Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
224
Глава 7
3.2. Бивалентные системы
Хроматография с зональным элюированием может быть также использована для расчетов в системах бивалентного связывания, включая представленные в уравнении (4).
P2U
Kf
Как описано для систем моновалентного связывания (см. работы [9, 10]), эта схема приводит к выражению:
1 + 2
[L
Kl
V-Vn
[Ll
Kl
2T1 +
[L) У [L] [L]
(5)
Это выражение позволяет оценивать константы диссоциации Kl и kl для бивалентных веществ P2 путем измерения v при различных значениях [L]. Однако в отличие от систем моновалентного связывания для бивалентных систем зависимость 1/(v—vo) от [L] нелинейна. Таким образом, Kl и kl находят по данным конкурентного элюирования путем обработки нелинейной зависимости методом наименьших квадратов. Несмотря на это различие, методика для получения данных в случае систем бивалентного связывания полностью аналогична таковой для моновалентной системы.
Количественная аффинная хроматография
225
Если зональное элюирование осуществляется в отсутствие растворимого лиганда ([L] =0), уравнение (5) упрощается:
V-V0 = (V0-VJ
Kr
[L]
Kr
(6)
При [L]=O Kl можно найти непосредственно по объему элюирования при одном зональном элюировании.
4. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АФФИННЫХ МАТРИЦ
Развитие аффинной хроматографии для препаративного выделения макромолекул привело к разработке многочисленных методов иммобилизации лигандов на твердых носителях. Рамки настоящей главы не позволяют рассмотреть все известные методы иммобилизации, однако остановимся на нескольких общих принципах конструирования аффинных матриц, предназначенных для использования в аналитической аффинной хроматографии.
4.1. Иммобилизация лиганда
При установлении констант равновесного связывания по данным хроматографии с зональным элюированием весьма важно, чтобы емкость колонки и сродство подвижного компонента к иммобилизованному лиганду соответствовали друг другу, только тогда можно получить в течение разумных промежутков времени вполне четкие кривые элюирования. Получение четких кривых элюирования зависит от ряда параметров, таких, как размер шариков и пор матрицы, диаметр и длина колонки и скорость потока [11, 12]. Кроме того, удерживание подвижного компонента непосредственно зависит от количества лиганда, присоединенного к матрице [1, 3]. При постоянной скорости потока и постоянном объеме колонки зоны подвижного компонента, введенного на матрицу с меньшим количеством иммобилизованного лиганда, элюируются в виде более острых пиков при меньших объемах элюирования. Увеличение количества иммобилизованного лиганда приводит к более широким пикам и большим объемам элюирования. Для установления соответствующей концентрации иммобилизованного лиганда для данной серии экспериментов обычно прибегают к методу проб и ошибок. Концентрация присоединенного к твердому носителю лиганда может первоначально контролироваться путем введения в реакцию с активированным твердым носителем определенных количеств лиганда. Дальнейшим исследованием ряда препаратов матрицы с различной плотностью лиганда можно опреде-
226
Глава 7
лить оптимальную для данного подвижного компонента концентрацию лиганда. По другому способу носитель вводят в реакцию с большим количеством лиганда и затем разбавляют немодифицированной матрицей до достижения требуемой концентрации иммобилизованного лиганда. Последний метод менее желателен в случае, если высокая плотность лиганда концентрированной аффинной матрицы вызывает удерживание подвижного компонента благодаря поливалентному связыванию или стерическим трудностям.
Присоединение лигандов к твердым носителям включает две стадии — активацию твердого носителя и присоединение лиганда к активированному носителю. В некоторых случаях включаются дополнительные стадии присоединения вставок различной длины к твердому носителю. Затем лиганды могут быть присоединены к свободному концу вставки. В целом стратегия иммобилизации обычно зависит от выбранного лиганда, доступности материалов (носитель и лиганд) и очевидной необходимости сохранения биоспецифичности и контролируемой емкости. В других отношениях химическая стратегия получения аффинных матриц для аналитических или препаративных целей по существу аналогична.
4.2. Определение емкости
Если аффинная матрица предназначена для аналитических целей, необходимо определить емкость модифицированного материала. Емкость замещенной матрицы может быть функционально определена как концентрация иммобилизованного компонента, доступного для взаимодействия с подвижным компонентом. Для моновалентной /(1: 1) системы емкость может быть определена как количество подвижного компонента, связывающегося в условиях насыщения на единицу объема упакованного геля. Если связывание не эквимолярное (например, при мульти-валентном связывании подвижного компонента с иммобилизованным компонентом), расчет функциональной емкости матрицы может оказаться ошибочным (занижен для мультивалентного подвижного компонента). Кроме того, измерение емкости матрицы этим методом может оказаться сложным, если сродство между взаимодействующими компонентами слишком мало для предотвращения преждевременного элюирования подвижного компонента. Насыщение матрицы может быть также невозмож^-ным, если подвижный связывающий компонент, особенно макромолекула или макромолекулярный комплекс, недоступен в достаточных количествах. В случае невозможности определения функциональной емкости матрицы наиболее целесообразно установить полное количество иммобилизованного компонента на единицу объема матрицы. Методы определения емкости матрицы приведены ниже.
