Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 90

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 106 >> Следующая

6.2. Бивалентный иммуноглобулин A (TEPC 15 IgA мономер) — фосфорилхолин
При конкурентном элюировании бивалентных мономеров TEPC 15 IgA, полученных восстановлением и селективным алки-лированием TEPC 15 IgA, с иммобилизованного фосфорилхоли-на при концентрации лиганда 5-Ю"5 моль/л (функциональная
16*
236
Глава 7
1,5 - _ і i 0,6
- L 0,4 і-
Ю A 0,2 і—*—Ґ*""^ ,Iii
0,5 f тік4 і 2 4 6 8 10 [L]mo4 \ 1
25 50 75 100
Объем элюирования, мл
Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [14C]IgA (бивалентное связывание) наносили на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [L]=S-IO-5 моль/л), уравновешенную NaCl-натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного ¦альбумина); фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л): 1 — 0; 2—1-Ю-6; 3 — 2,5-10"6; 4-5,0-10"6; 5 —7,5-10"6; ?—1,0-10"5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(V-V0) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации Kl и /Cl рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].
емкость) в присутствии растворимого фосфорилхолина зависимость 1/(V—V0) от концентрации растворимого конкурентного лиганда нелинейна [9] (рис. 5), что согласуется с вероятностью бивалентного связывания мономера IgA с аффинной матрицей. Вследствие этого параметры взаимодействия Kl и Kl были рассчитаны с использованием бивалентной модели [уравнение (5)]. Найденные значения приведены в табл. 1. Если бивалентный IgA элюируется с фосфорилхолин-сефарозы при концентрации иммобилизованного лиганда 9•1O-6 моль/л, изменение объема элюирования при изменении концентрации растворимого фосфорилхолина согласуется, как показано на рис. 6, с моновалентной моделью. В этом случае при уменьшенной плотности связывающих положений матрицы исключается сколько-нибудь значительная возможность одновременного связывания белка по двум положениям матрицы. Таким образом, как моновалентная, так и бивалентная модели могут использоваться для расчета значений Кь и Kl, что отражено в табл. 1.
Количественная аффинная хроматография
237
2 3 4 5 6
Объем элюирования, мл
Рис. б. Конкурентное зональное элюирование бивалентных мономеров IgA с фосфорилхолин-сефарозы с низким содержанием лиганда. Зоны мономера [14C]IgA наносили на фосфорилхолин-сефарозу с низкой плотностью лиганда (7x25 мм, [L]=9• 1O-6 моль/л); условия элюирования аналогичны приведенным на рис. 5 для колонки с фосфорилхолин-сефарозой с высокой плотностью; использованы следующие концентрации растворенного фосфорилхолина (моль/л): /—0; 2— Ы0~7; 3 — 5-Ю"7; 4 — Ы0-6; 5-2,5-10"6. В правом верхнем углу построена зависимость 1/(K—V0) от [L] [9].
В то время как элюирование мономера IgA при более высокой концентрации аффинной матрицы (5-Ю-5 моль/л) приводит к нелинейным зависимостям 1/(F—V0) от [L], элюирование моновалентных Fab-фрагментов, полученных из IgA, с той же самой матрицы свидетельствует о линейном поведении (рис. 7). Это подтверждает вывод о том, что отклонение от линейности в случае мономеров IgA на самом деле обусловлено возникающим бивалентным связыванием с аффинной матрицей при близком расположении положений связывания (высокая плотность замещения).
6.3. Бычий нейрофизин II — пептиды
Поведение БНФ-П при зональном элюировании с Met-Tyr-Phe-аминоалкил-агароз соответствует схеме кооперативного связывания, отличающейся от строго моновалентных или бивалентных моделей. Объемы элюирования обычно уменьшаются с увеличением концентрации конкурентного пептида (например, окситоцина или вазопрессина) в элюирующем буфере, как показано, например, на рис. 3. Однако, когда полученные при кон-
238
Глава 7
2 ' 4
[l]mo6
Рис. 7. Элюирование Fab-фрагментов [3H]IgA на колонке с фосфорилхо-лин-сефарозой с высокой (а) и низкой (б) плотностью лиганда. Хромато-графические условия элюирования зон Fab-фрагментов [3H]IgA аналогичны приведенным на рис. 5 для мономера IgA. Константы диссоциации Kl и Kz рассчитаны по линейным графикам с использованием уравнения (2) и приведены в табл. 1 [9].
курентном элюировании данные были выражены графически как If(V—V0) от [L], в большинстве случаев наблюдалось отклонение от линейности при низких [L] (рис. 8). Причина этого поведения объясняется тем фактом, что нейрофизин представляет собой смесь мономеров с низким сродством и димеров с высоким сродством, причем степень димеризации увеличивается при связывании с пептидным лигандом. Таким образом, в то время как элюирование нейрофизина в отсутствие растворенного лиганда отражает аффинное связывание с матрицей смеси, содержащей значительное количество мономеров, элюирование в присутствии низкой концентрации растворенного пептида оказалось более замедленным, чем ожидалось; это отражает элюи-
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed