Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
3.2.3. Тиолирование лиганда.
1) К 1 мл раствора лиганда, содержащего 1—2 мг лектина (или антитела) в 1 мл 125 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), добавляют свежеприготовленный раствор S-АМЯА (Sigma) (50— 100 мМ) в диметилформамиде (20 мкл раствора S-АМЯА на 1 мл раствора лиганда).
2) Осторожно перемешивают смесь путем вращения в течение 2 ч при комнатной температуре.
3) Для удаления непрореагировавшего S-АМЯА проводят диализ против 125 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) или гель-фильтрацию через небольшую колонку трисакрила GF 05, уравновешенного тем же буфером.
4) Для измерения степени тиолирования лиганда S-ацетил-производное лиганда обрабатывают гидроксиламином (добавляют до конечной концентрации 20 ммоль/л) в течение 1 ч при комнатной температуре и определяют содержание SH-групп по методике, описанной в работе [36]. Для этого добавляют равный объем 2 мМ дитиопиридина в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,0) и измеряют увеличение оптической плотности при 343 нм (молярный коэффициент экстинкции продукта реакции — тиопиридона — составляет 8,08•1O3); измерение надо проводить сразу же после добавления раствора дитиопиридина ввиду медленной реакции последнего с гидроксиламином.
3.2.4. Иммобилизация лиганда на мерсалил-трисакриле.
1) S-Ацетилпроизводное лиганда (0,5--2 мг/мл; в 125 мМ фосфатном буфере, pH 7,0) смешивают с равным объемом упакованных шариков мерсалил-трисакрила в том же буфере.
2) Смесь перемешивают (путем вращения) в течение 12— 16 ч при комнатной температуре в темноте.
3) Гель тщательно промывают фосфатным буфером, затем 10 мМ трис-HCl (pH 7,5), содержащим 0,5 M NaCl.
4) Шарики вновь суспендируют в среде, выбранной для связывания клеток.
Контрольные эксперименты показывают, что нетиолирован-ный лиганд не присоединяется к шарикам. Однако для неко-
254
Глава 8
Рис. 5. Связывание тимоцитов мыши с Con А-мерсалил-трисак-рилом. Тимоциты мыши инкубировались в течение 20 мин при комнатной температуре с Con A-мерсалил-трисакриловыми гелями или с различными контрольными гелями (5•1O7 клеток в 250 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl на 100 мкл геля). После удаления несвязавшихся клеток повторным промыванием шарики были исследованы под оптическим микроскопом, а — контрольные гели (трисакрил, трисакрил-NH2, мерсалил-трисакрил без Con А, мерсалил-трисакрил, предварительно обработанный нетио-лированным Con А, или трисак-рил-ЫН2, предварительно обработанный Con A-S-Ac); б — Con A-мерсалил-трисакрил; в — Con A-мерсалил-трисакрил после связывания тимоцитов и обработки 50 мМ дитиотреитолом, 2%-ным метил-а-О-маннопиранозидом в 10 мМ трис-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl в течение 30 мин при комнатной температуре при очень осторожном перемешивании.-
торых рядов антител может иметь место слабое связывание (наблюдаемое по последующему связыванию клеток) в результате неспецифических взаимодействий или нежелательных (неизвестных) реакций мерсалила с белками; это связывание можно подавить включением бычьего сывороточного альбумина (0,5% масс/об.) в процессы иммобилизации.
3.2.5. Связывание клеток с лиганд-мерсалил-трисакриловыми гелями. Возврат связавшихся клеток обработкой тиолом. Поскольку на колонках может механически задерживаться значительное количество клеток, предпочтительнее применять бетч-метод.
Разделение клеток
255
1) Лиганд-мерсалил-трисакр иловый гель (контрольный гель) диспергируют в сосуде с большой поверхностью, распределяя шарики по поверхности.
2) Гели инкубируют с клеточной суспензией при периодическом и очень осторожном перемешивании.
3) После удаления несвязавшихся клеток и повторного осторожного промывания часть шариков переносят в счетную камеру для микроскопического исследования.
4) Для удаления связавшихся клеток шарики обрабатывают раствором, содержащим тиол, при периодическом осторожном перемешивании.
3.3. Применения
Далее описаны три модельных исследования, демонстрирующие возможности этой методологии.
3.3.1. Связывание тимоцитов с Con А-мерсалил-трисакрилом. Элюирование дитиотреитолом. Первоначальные эксперименты были проведены с СПТП-тиолированным Con А [31], хотя впоследствии было обнаружено, что метод с использованием S-АМЯА более удобен. Растворы Con A (Pharmacia) (2 мг/мл) тиолируют, как указано в разд. 3.2, с использованием 1— 2 ммоль/л S-АМЯА (конечная концентрация); это приводит к введению 1,5ч-3,3 S-ацетильных групп на молекулу Con А. Количество иммобилизованного Con А, определенное с [3H] Con А (фирма NEN), составляет —60 мкг/мл геля.
Тимоциты мыши инкубируют с Con А-мерсалил-трисакрилом или с различными контрольными гелями. После 20 мин инкубации с последующим промыванием для удаления несвязавшихся клеток, шарики исследуют под оптическим микроскопом (рис. 5). На рис. 5, а приведены результаты, полученные с контрольными гелями. Ни в одном случае не было обнаружено значительного связывания тимоцитов с шариками, что свидетельствует об отсутствии сколько-нибудь значительного неспецифического взаимодействия матрицы на основе трисакрила с клетками и об отсутствии неспецифически адсорбированных на шариках Con A-S-Ac или нетиолированного Con А.
