Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
На рис. 5,6 показаны Con А-мерсалил-трисакриловые шарики, полученные, как описано выше, после инкубации с тимоци-тами мыши: шарики покрыты клетками. Связавшиеся клетки не элюируются 2%-ным (масс./об.) метил-а- D-маннопиранози-дом, который специфически связывается с Con А.
Возврат связавшихся тимоцитов легко достигается при обработке 50 мМ дитиотреитолом, содержащим метил-а-о-маннопи-ранозид (2%-ным масс./об., добавлен для предотвращения вы-
256
Глава 8
Рис. 6. Связывание ТНБС-меченых эритроцитов с анти-ДНФ-мерсалил-трис-акрилом. Эритроциты барана инкубировались в течение 20 мин при комнатной температуре с анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловыми гелями или различными контрольными гелями (2¦1O8 клеток в 250 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 7,5 0,15 M NaCl на 100 мкл геля) в сосудах с большой поверхностью при очень осторожном периодическом перемешивании. После удаления несвязавшихся клеток промыванием шарики исследуют под оптическим микроскопом, а — анти-ДНФ-мерс ал ил-трис а крил о вые шарики+немеченые эритроциты; б — ТНБС-меченые эритроциты+мерсалил-трисакриловые шарики, предварительно обработанные нетиолированными анти-ДНФ; в — анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловые шарики+ТНБС-меченые эритроциты; г — диссоциация ТНБС-меченых эритроцитов, первоначально связавшихся с анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловыми шариками, после 30-минутной обработки 50 мМ дитиотреи-толом в 10 мМ трис-НСІ, 0,12 M NaCl (pH 7,5).
Разделение клеток
257
зываемой Con А агглютинации элюированных клеток). На рис. 5, в представлены тимоциты, диссоциированные с аффинного носителя после 30-минутной обработки этим элюентом. Около 70% связавшихся клеток элюируется за 30 мин, а при более продолжительной обработке могут быть удалены все клетки. Можно показать, что элюированные дитиотреитолом тимоциты жизнеспособны, так как они не поглощают трипан голубой и нормально стимулируются Con А, что продемонстрировано экспериментами по включению [3Н]тимидина [31].
3.3.2. Связывание ТНБС-меченых эритроцитов с анти-ДНФ-мерсалил-трисакрилом. Возврат обработкой тиолом. Эксперимент состоит в иммобилизации тиолированных анти-ДНФ-анти-тел на мерсалил-трисакриле и связывании ТНБС-меченых эритроцитов барана, узнаваемых анти-ДНФ-антителами.
1) Раствор (1 мг/мл) моноклональных анти-ДНФ-антител (поставляется Clin Midy-SANOFI Research Center) тиолируют по методике, описанной в разд. 3,2, используя 1—2 мМ S-АМЯА; это приводит к введению 1,7—3,5 S-ацетильных групп на молекулу антитела.
Количество связавшихся антител, определенное с ^-мечеными антителами, должно составлять ~1 мкг/мл геля.
2) Эритроциты барана обрабатывают тринитробензолсуль-фоновой кислотой (ТНБС) по методике, описанной в работе [37].
3) ТНБС-меченые эритроциты барана инкубируют с анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловыми гелями или различными контрольными гелями в сосуде с большой поверхностью при периодическом осторожном перемешивании.
4) После инкубации в течение 20 мин и удаления несвязавшихся клеток путем многократного промывания шарики исследуют под оптическим микроскопом.
На рис. 6, а приведены анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловые шарики, инкубированные с немечеными эритроцитами; эритроциты не связываются с носителем. ТНБС-меченые эритроциты, инкубированные с мерсалил-трисакрилом, предварительно обработанным нетиолированными анти-ДНФ, показаны на рис. 6, б; связывание клеток не происходит, что указывает на отсутствие неспецифической адсорбции антител на шариках. На рис. 6, в показаны анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловые шарики, инкубированные с ТНБС-мечеными эритроцитами; шарики полностью покрыты эритроцитами, которые не элюируются при промывании. На рис. 6,г представлена диссоциация ТНБС-меченых эритроцитов, первоначально связавшихся с анти-ДНФ-мерсалил-трисакриловыми шариками, после 30-минутной обработки 50 мМ дитиотреитолом. Все клетки элюируются, гемолиза эритроцитов не наблюдается. Количество эритроцитов, связавшихся с матри-
258
Глава 8
Рис. 7, Связывание тимоцитов мыши с анти-Тпу-1,2-мерсалил-трисакрилом. Тимоциты мыши инкубировались в течение 2 ч при 4 °С с анти-Тпу-1,2-мерсалил-трис-акрилом в среде Хенка, содержащей 0,1% (масс/об.) БСА и 0,1% (масс/об.) азида натрия (108 клеток в 250 мкл среды на 50 мкл геля). После удаления не-связавшихся клеток промыванием шарики исследовали под оптическим микроскопом, а — анти-Thy-1,2-мерсалил-трисакрил -f тимоциты Тпу-1,2-положительной линии мышей (C57/BL6); б — анти-Thy-1,2-мерсалил-трисакрил+Тпу-1,2-положительные тимоциты после 2-часовой обработки 25 мМ дитиотреитолом в среде Хенка; в — анти-Тпу-1,2-мерсалнл-трисак-рил+тимоциты Thy-1,1-положительной линии мышей (С57/КА).
цей и элюированных расщеплением Hg—S-связи тиолом, составляет 109/мл геля.
3.3.3. Связывание тимоцитов мыши с анти-Thy-l,2-мерсалил-три-сакрилом. Элюирование дитиотреитолом. Первые результаты были получены с иммобилизованными антителами, узнающими природные антигены клеточной поверхности [38].
1) Раствор (2 мг/мл) моноклональных анти-ТЬу-1,2-антител (поставляется Clin-Midy-SANOFI Research Center) тиолируют по методике, описанной в разд. 3.2, используя 1 мМ S-АМЯА (конечная концентрация).
