Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Количественная аффинная хроматография
239
О 35 70 105 140 О 35 70 Ю5
[окситоцин]* IQ"6, моль/л [лизинвазопрессин] • Ю~6, моль/л
Рис. 8. Линейные графики данных конкурентного зонального элюирования [1251]-меченного бычьего нейрофизина II ([,251]-БНФ-П с Met-Tyr-Phe-аминогексилагарозы (а) и Met-Tyr-Phe-аминобутил-агарозы (б) (колонки с 2 мл сорбента, внутренний диаметр 7 мм). Результаты элюирования для серии опытов, показанных на рнс. 3, и трех других аналогичных серий (здесь приведены графически в виде зависимости 1/(V—V0) от концентраций конкурентного лиганда [L], который в этом случае являлся ней-ропептидным гормоном окситоцином или лизиивазопрессином). /—элюирование при низкой общей концентрации белка в зоне, нанесенной на колонку (только <1 мкг [125I]-БНФ-И); 2 — элюирование при высоком общем количестве белка, нанесенного на колонку (1 мкг [125I]-БНФ-П+101 мкг или 41,5 мкг немеченого БНФ-П). Прямые построены путем обработки экспериментальных данных по методу наименьших квадратов; вблизи [L]=O наблюдается отклонение от линейности, и эта область не учитывалась при построении прямых. Константы диссоциации Kl и /Cl, рассчитанные по линейным графикам с использованием уравнения (2) и (3), приведены в
табл. 1 і [4].
рование смесей, существенно обогащенных димерами с высоким сродством. Увеличение низких концентраций растворенного пептида приводит к более плавному уменьшению объемов элюирования, чем ожидалось на основании степени конкурирования растворенных пептидов и аффинной матрицы за связывание с нейрофизином, находящимся в растворе [4].
Более высокое сродство димеров к пептидам по сравнению с мономерами выражается также в сильной зависимости объема элюирования нейрофизина от количества (т. е. концентрации) нейрофизина в первоначальной зоне. Так, увеличение концентраций белка в зоне приводит к увеличению удерживания (рис. 9).
240
Глава 7
6.4. Нейрофизин — нейрофизин
Степень димеризации нейрофизина была установлена при элюировании нейрофизина с иммобилизованного нейрофизина. Как показано в правом верхнем углу рис. 10, зональное элюирование [125I] БНФ-П в буфере (не содержащем растворенного пептидного лиганда) свидетельствует об удерживании, достаточно отличающемся от V0» что позволяет рассчитывать константу димеризации как /Cl (табл. 1). При включении растворимого
Номер фракции
Рис 9. Влияние концентрации введенного на колонку бычьего нейрофизина II (БНФ-П) на характер зонального элюирования с Met-Tyr-Phe-амино-бутил-агарозы. Зоны (100 мкл), содержащие <1 мкг [125I]-БНФ-П и немеченый БНФ-П (различные количества), элюировали 0,4 M ацетатом аммония (pH 5,7) в отсутствие растворенного конкурентного лиганда. Каждая кривая соответствует содержанию (в микрограммах) дополнительно введенного немеченого БНФ-П в зоне: 7—0; 2 — 6,35; 3— 10,3; 4 — 20,7; 5 — 41,3; 6 — 82,6. Элюирование проводили при комнатной температуре [4].
пептидного лиганда в элюирующий буфер константы диссоциации димеров также могут быть определены для нейрофизина, частично или полиостью связанного с лигандом. Основная кривая элюирования на рис. 10 отражает случай «близкого к насыщению» лизинвазопрессина. Для этого случая /Cl гораздо меньше (большее сродство), чем в буфере без лиганда (табл. 1). Таким образом, здесь, как и в случае пептидной аффинной матрицы, зональное элюирование нейрофизина может быть использовано для измерения степени модуляции сродства в кооперативных комплексах между нейрофизинами и пептидными гормонами.
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Аналитическая аффинная хроматография с зональным элюированием была изучена на многих макромолекулярных системах. Было показано, что этот метод достаточно простой в экспе-
Количественная аффинная хроматография
241
100 150
Объем элюирования, мл
Рис. 10. Элюирование [,251]-БНФ-П с БНФ-Н-сефарозы в присутствии и отсутствие растворенного пептидного лиганда — лизинвазопрессина. Зоны (300 мкл), содержащие ~_1 мкг [125I]-БНФ-ІІ, наносили на БНФ-сефарозу (объем сорбента 1,5 мл, [L] = 1,4-10"4 моль/л), уравновешенную 0,4 M ацетатом аммония (pH 5,7), содержащим 0,1 ммоль/л лизинвазопрессина (основной график) или в отсутствие лизинвазопрессина (график в правом верхнем углу). Объемы зонального элюирования были использованы для расчета константы диссоциации для взаимодействия белок — белок /? п0 Уравнению (3). Эти значения приведены в табл. 1 [21].
риментальном отношении и весьма полезен для оценки взаимодействий макромолекул. Все более широкое применение этого метода в нескольких лабораториях [26] отражает его потенциальные преимущества для изучения биомолекулярных взаимодействий и в этой связи молекулярных основ функционирования биологических систем.
Литература
1. Dunn Б. M4 Chaiken L M., Proc Natl. Acad. Sei USA, 71, 2382 (1974).
2. Chaiken L M., Anal. Biochem., 97, 1 (1979).
3. Dunn ?. M4 Chaiken I. M., Biochemistry (Wash.), 14, 2343 (1975).
4. AngalS., Chaiken /. Af., Biochemistry (Wash.), 21, 1574 (1982).
5. Chaiken L M4 Taylor H. C4 J. Biol. Chem., 251, 2044 (1976).
6. Hethcoie H. W4 DeLisi C4 J. Chromatogr., 248, 183 (1982).
