Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Количество связавшегося мерсалила, определенное с использованием [14C] мерсалила, составляет 0,2 мкмоль/мл геля. Число доступных молекул иммобилизованного мерсалила устанавли-
вается насыщением колонок с мерсалил-трисакрилом тиосали-циловой кислотой — тиолом, содержащим хромофорную группу,— с последующим элюированием связавшейся тиосалицило-вой кислоты при промывании колонки избытком дитиотреито-ла; было найдено, что матрица содержит —0,1 мкмоль мерсали-ла/мл геля, что не очень отличается от величины, определенной по связыванию [14С]мерсалила. Хотя количество иммобилизованного мерсалила представляется довольно низким, оно достаточно для насыщения поверхности шариков тиолированными ли-гандами, имеющими размер лектинов или иммуноглобулинов.
ЗАЛ, Тиолирование лигандов и иммобилизация тиолированных лигандов на мерсалил-трисакриле. Лиганды [конканавалин А (Con А), антитела] могут быть тиолированы, как описано в работе [35], с использованием S-ацетилмеркаптоянтарного ангидрида (S-АМЯА) в качестве тиолирующего агента (рис. 3).
Иммобилизацию на мерсалил-трисакриле через Hg—S-связь можно осуществить, как показано на рис. 3. Первые эксперименты по иммобилизации [31] были осуществлены путем одновременного смешивания S-ацетилпроизводного лиганда, мерса-лил-трисакрила и гидроксил амина и получения in situ SH-функциональных групп модифицированного лиганда [35], Однако S-ацетилированный лиганд может реагировать непо-
ээдх j
Трисакрил-NH -CO-CHj-O
^ мерсалил-трнсакрил
Рис 2, Присоединение мерсалила к трисакрилу-NHa.
Разделение клеток
251
средственно с иммобилизованным мерсалилом без восстановления гидроксиламином S-ацетильной группы [31], что исключает возможное окисление SH-rpynn.
Степень тиолирования лиганда (контролируется путем определения SH-групп классическим методом [36] после обработки S-ацетилпроизводного гидроксиламином [35]) можно задавать, подходящим образом регулируя концентрацию лиганда и S-АМЯА. Если степень тиолирования лиганда слишком высо-
лиганд-МН2 +
O
О ' О
S-CO-CH.
S-АМЯА
лиганд-NH -CO-CH-S-CO-CH3 CH2-CO^
мерсалил -трисакрил
лиганд- S-ацетил \ NH2OH лиганд - SH
/ мерсалил-трисакрил
трисакрил-NH-CO-мерсалил -Hg-S-лиганд
лиганд - мерсалил - трисакрил Рис. 3. Иммобилизация лигандов на мерсалил-трисакриле.
ка, то возникают затруднения при удалении с носителя клеток, первоначально связавшихся с носителем: это обусловлено, вероятно, дополнительным многоточечным связыванием между лигандом и молекулами мерсалила на носителе. Степень иммобилизации лиганда может быть определена при помощи радиоактивно меченных лигандов ([3Н]конканавалин А, 1251-меченный IgG).
3.1.5. Связывание клеток с лиганд-мерсалил-трисакриловыми носителями. Возврат клеток обработкой тиолами. Клетки, обладающие поверхностными компонентами, узнающими иммобилизованный лиганд, инкубируются с лиганд-мерсалил-трисакрило-вым гелем и различными контрольными гелями. Возврат связавшихся клеток достигается путем обработки тиолом. Принцип выделения клеток с использованием лиганд-мерсалил-трисакри-ла изображен на рис. 4.
17*
252
Глава 8
В результате обработки тиолом клетки выделяются с молекулами лиганда, моновалентно связанными с поверхностью клеток. Эти молекулы лиганда могут быть либо удалены путем обработки конкурентными агентами (так, в случае лектинов комплексы разрушаются сахарами), либо поглощены клетками в результате эндоцитоза (в случае антител).
3.2. Методики
3t2.L Введение аминогрупп в шарики трисакрила.
1) Шарики трисакрила (Trisacryl GF 05, Reactifs IBF) (30 мл) обрабатывают 25%-ным (масс/об.) тетрафтороборатом цинка (22,5 мл) и эпихлорогидрином (60 мл) в течение 3 ч при 80 0C и осторожном перемешивании.
2) Реакционную смесь охлаждают, шарики промывают дистиллированной водой и вновь суспендируют в 2,0 M аммиачном буфере (NH4OH + NH4CI, pH 9,0; 100 мл).
3) Суспензию осторожно перемешивают при комнатной тем-
пературе в течение 16 ч и шарики тщательно промывают дистиллированной водой.
3.2.2. Иммобилизация мерса-лила на шариках трисакрила-NH2. Конденсацию проводят в смеси этанол — вода (1:1) по методике, описанной в работе [33].
1) К шарикам (17 мл упакованного объема) добавляют воду (13 мл) и этанол (27,5 мл).
2) Мерсалил (Sigma) (200 мг) растворяют в 0,15 M NaOH (3,3 мл), доводят pH до 7,5 с помощью 2,0 M HCl и добавляют этанол (3,4 мл).
Быстро выливают полученный раствор мерсалила в этанол (2,5 мл), содержащий ЭЭДХ (Aldrich) (300 мг).
4) Энергично встряхивают в течение 2 мин и добавляют ЭЭДХ-мерсалил к шарикам трисакрила-ЫНг.
5) Перемешивают смесь путем вращения в течение ночи при комнатной температуре.
6) Шарики тщательно промывают смесью этанол — вода (1: 1) (1,5 л), водой (1 л) и 1,0 M NaCl (1 л).
Мерсалил-трисакрил должен быть защищен от света; его можно хранить в замороженном виде при —20 °С.
J-— H9-S R HS-SjK^X
J-—Hg-SR HS-gl^^/
Рис. 4. Выделение клеток с исполь зованием лиганд-мерсалил-трисакри ла.
Разделение клеток
253
Использование в предыдущем эксперименте [14C] карбамоил-мерсалила (CEN, Saclay) позволяет определить количество иммобилизованного мерсалила. Для этой же цели можно применить следующую методику. Колонку с гелем уравновешивают в 50 мМ фосфате (pH 6,2), содержащем 0,15 моль/л NaCl и 1% (об./об.) луброла PX, и насыщают 20 мМ тиосалициловой кислотой; связавшуюся тиосалициловую кислоту элюируют 20 мМ дитиотреитолом в том же буфере и определяют количество элюированной тиосалициловой кислоты методом УФ-спектрофо-тометрии.
