Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
5.2. Экстраполяция результатов к неопределенной концентрации растворенного вещества
Экстраполяция результатов к неопределенной концентрации растворенного вещества была первоначальным подходом [18] к решению проблемы определения тх, основанным на том, что
208
Глава 6
при їИа-+00 все доступные положения связывания матрицы становятся насыщенными в случае молекул одноточечно связанного растворенного вещества [27]. Так, в исследованиях по рецир-кулирующему распределительному равновесию системы фосфо-целлюлоза — альдолоза величина отсекаемого отрезка по оси ординат, полученная из_графика, построенного в обратных координатах [т. е. l/VA*(mA—тА) от ![тпа], была использована [18] для количественной оценки числа положений связывания
Рис. 4. Анализ результатов распределительного равновесия [18 (табл. I)J для взаимодействия альдолазы с фосфоцеллюлозой. а — количественная оценка числа положений связывания матрицы (V\*mx) для альдолазы в 0,783 г фосфоцеллюлозы экстраполяцией результатов к неопределенной концентрации фермента; б — зависимость, построенная с использованием уравнения (4) для одновременного определения &Ах и Уа*Шх с учетом тетрава-лентности альдолазы (f=4).
матрицы с помощью VA*mx. По существу тот же метод был также применен для изучения распределительного равновесия при взаимодействии между альдолазой и миофибриллами мышц [28], за исключением того, что количество связанного фермента было выражено в виде функции FA* (піа—ша) Iwx, где wx — масса аффинной матрицы. Поскольку, как отмечено выше, Уаша = ^а*^а> вполне логично представить результаты фронтальной хроматографии в виде графика l/mA(FA—Va*) от_1/тпа и тогда на оси ординат отсекается отрезок, равный 1/УА*^х.
Как отмечено в первой публикации, посвященной рассматриваемому подходу [18], экстраполяция такого рода графиков в обратных координатах носит несколько неопределенный характер; гораздо нагляднее те же результаты представить в виде скатчардовской кривой [33] (рис. 4, а), для которой на оси абс-
Характеристика взаимодействий
209
Таблица 3. Определение констант связывания для взаимодействий
альдолаза — фосфоцеллюлоза и альдолаза — фосфат методом аффинной
хроматографии»
ms, мМ пгА, мкМ Шд, мкМ тх, мкМ ftAX-10-\ л/мольа fcAS, л/мольб
1,33 0,25 11,60 5,32
— 2,08 0,46 11,36 5,24 _
— 3,15 0,89 11,02 4,89 —
— 4,27 1,44 10,67 4,72 —
— 5,83 2,28 10,18 4,98 —
— 6,78 2,80 9,88 5,48 —
1,00 0,113 0,069 3,09) 180
1,00 0,224 0,143 3,07 280
1,00 0,335 0,221 3,06 360
1,00 0,662 0,443 3,02 340
1,00 0,769 0,509 3,01 270
1,00 0,875 0,593 3,00 5,1а 330
5,00 0,080 0,055 3,58 170
5,00 0,160 0,125 3,57 370
5,00 0,239 0,191 3,57 420
5,00 0,319 0,261 3,56 490
5,00 0,397 0,322 3,55 460
5,00 0,554 0,456 3,54 500
Результаты из работы [18, табл. 1 и 2]. 6 Рассчитано по уравнению для примера 3 в табл. 2 (см. текст). в Среднее значение kAX по экспериментам с ms«-0.
цисс отсекается отрезок, соответствующий сделанному ранее выводу [18], что для насыщения доступных положений связывания фосфоцеллюлозы необходимо 167 нмоль альдолазы. Несмотря на очевидную неопределенность такой экстраполяции, с помощью графика можно найти тх, после чего kAx может быть получена из любого эксперимента (путем измерения тА, тА или тА, VA*/FA) как единственный неизвестный параметр в уравнении, описывающем связывание тетравалентного фермента (табл. 2, пример 3 с f = 4 и ms = 0). Некоторые результаты из работы [18] суммированы в табл. 3. Кроме того, значение тх можно уточнить, используя метод последовательных приближений при обработке kAx.
5.3. Одновременное определение kAX и П1х графическими методами
Хотя описанный выше метод определения тх был применен в двух работах [18, 19], совершенно очевидно, что подобные экстраполяции лучше исключить. В недавнем повторном исследовании этой проблемы [22] для примера 3 предложено еле-
210
Глава 6
дующее преобразованное выражение:
[ 1 - (VVWl _ _ *Ахтх _ /&ах [ 1 - (У*AlVа№\ (Vа/У*а) тА ( У*а/Уа)1п 1 + aas«s 1 + bAyns
(4)
Из уравнения (4) очевидно, что_ при данной валентности f растворенного вещества значение тх может быть в принципе-получено из ?рафика__ [1—(KaVKa)1^] (^aVFa)17' от [1 — — {VA*/Va)1^][VaIV a*) mAi как отношение наклона к отсекаемому отрезку; с этой целью ставится ряд экспериментов при одной и той же концентрации лиганда ms, но рядом значений тА. Подобные результаты наиболее легко получить из экспериментов-по распределительному равновесию в системе альдолаза — фос-фоцеллюлоза [18], принимая во внимание, что (VA*/VA) = = (тА/тА). На рис. 4,6 приведен подобный график, причем вычисления по методу наименьших квадратов привели к следующему: VA*mx=154(±18) нмоль и ?Ах=5,8(±0,8) ¦ 104 M"1. Следует отметить, что эти данные подтверждают данные, получен-ные_ранее [18] с использованием метода экстраполяции: IVmx= 167 нмоль (рис. 4,а) и ?Ах = 5,Ы04 M"1 (табл. 3).
К естественному недостатку второго метода анализа относится, конечно, его зависимость от выбранного значения валентности f растворенного вещества. Хотя в приведенном выше примере установление числа активных положений в тетрамерной молекуле альдолазы не вызывает проблем, имеется, вероятно, много систем, для которых значение f также должно быть выведена на основе анализа результатов аффинной хроматографии. В этом отношении метод экстраполяции для получения тх, несмотря на свойственную ему неопределенность, независим от /, и поэтому валентность / может быть в принципе установлена путем анализа экспериментальных данных (табл. 3) для ряда возможных f и выбора соответствующего значения, при котором ?Ах сохраняется постоянным. Однако из-за неопределенности требуемой экстраполяции выше уже был предложен подход для уточнения значения fax при данном /. Возможно, что оптимальным, подходом является совместное применение обоих методов.
