Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
4.3. Приближенный анализ результатов аффинной хроматографии
Описанный выше анализ системы сефадекс — лизоцим — глюкоза показал, что для характеристики этого конкурентного процесса (КаХу Kas) требуется ряд экспериментов с различными концентрациями растворенного вещества (рис. 3,6), а также ряд опытов (при постоянной тА) при различных значениях Ws (рис. 3, а). Это подтверждает высказанное ранее положение, что для получения полной характеристики аффинной системы всегда необходимы две серии экспериментов. Однако во многих исследованиях в качестве первичной задачи ставится лишь определе-
.206
Глава 6
ниє констант равновесия для взаимодействия растворенное вещество — лиганд; в связи с этим логично выяснить, не будет ли меньшее число экспериментов достаточным для такой частичной характеристики аффинной системы.
Изучение уравнений, приведенных в табл. 1, показывает, что при использовании предложенных графиков для анализа фронтальных экспериментов все выражения для определения тангенса угла наклона содержат полную концентрацию растворенного вещества тА на прямолинейном участке графика (плато). Например, в рассматриваемой ситуации (пример 3) отношение наклон/отсекаемый отрезок дает (1 + /Cax^a)/^as- Если принять, что /Сах^а<1, то это отношение можно использовать для прямого измерения Kas] такое допущение правомочно при достаточно низкой концентрации растворенного вещества [3, 6]. Однако выводы, получаемые при таких приближениях, нельзя принять безоговорочно из-за неопределенности значения Ках> которое может быть гораздо больше, чем Kas, даже в случае, когда иммобилизованный реагент и лиганд — близкие или идентичные вещества [18]. Например, применение допущения к результатам, представленным на рис. 3, а, привело бы к заключению, что для взаимодействия лизоцим — глюкоза /Cas = 3 M-1; если принять последнее значение для Ках, т. е. для взаимодействия между ферментом и полиангидроглюкозной матрицей, то это дает, по-видимому, основания для пренебрежения членом Кахша в экспериментах с тА = 8,3 мкмоль/л. Однако исследования лизо-цима в отсутствие глюкозы показывают, что Ках не имеет ничего общего с Kas] на самом деле Кахша^ Ю, что приводит к 10-кратному занижению Kas при использовании описанных приближений.
Пренебрежение членом Кахша применяется в анализе результатов фронтальной хроматографии методом Касаи и Ишии [4]. Оно также положено в основу метода анализа результатов зональной хроматографии [2, 3, 5], когда при неизвестной Ша единственной возможностью для анализа остается допущение, что /САхтА<1. Конечно, существует много систем, для которых K\s, определенные методом приближенного анализа совпадали со значениями, установленными другими методами. Однако очевидно, что предпочтение следует отдать полному анализу, поскольку достоверность его результата не требует проверки другими методами.
5. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ МУЛЬТИВАЛЕНТНЫХ РАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
Множественные взаимодействия растворенных веществ с участками связывания матрицы рассматривались лишь в четырех исследованиях по количественной аффинной хроматографии.
Характеристика взаимодействий
207
В одном из них [14] для интерпретации фосфорилхолинзависи-мого элюирования иммуноглобулина А с сефарозы, содержащей ковалентно связанный фосфорилхолин (иммобилизованный реагент X), был использован приближенный анализ [17] результатов зональной хроматографии. Другие исследования были посвящены фосфатзависимому элюированию альдолазы с фосфо-целлюлозы [18] и с миофибрилл мышц кролика [28] и NADH-зависимому элюированию лактатдегидрогеназы с 10-карбокси-дециламино-сефарозы [32]. Все четыре системы относятся к примеру 3, включающему конкуренцию между S и X за положения связывания растворенного вещества.
5.L Суммарная концентрация доступных положений
Существенным этапом исследований по количественной аффинной хроматографии, включая как моновалентные, так и мультивалентные растворенные вещества, является определение суммарной концентрации доступных положений связывания матрицы. На этой стадии были разработаны методики для количественного определения тх, испытанные на системах, в которых А взаимодействует непосредственно с X (пример 3, но приемлемо также для примера 4). Однако ввиду отсутствия сообщений об исследованиях лигандзадерживаемого элюирования в системах с мультивалентным растворенным веществом, для этих систем не имеется экспериментально проверенных методик. Поэтому основное внимание уделяется главным образом методам измерения тх для систем, относящихся к примерам 3 и 4, после чего рассматривается возможное применение этих методов для анализа других ситуаций. Как и для соответствующих систем с моновалентным растворенным веществом, по степени взаимодействия растворенного вещества с аффинной матрицей в отсутствие лиганда вначале определяют тх и константу равновесия Ках растворенное вещество — матрица. Для определения эффективной суммарной концентрации положений связывания матрицы тх были предложены три методики по измерению количества связавшегося растворенного вещества как функции концентрации последнего в жидкой фазе тА; эта концентрация эквивалентна тА, поскольку А — единственная растворимая форма в отсутствие лиганда.
