Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Характеристика взаимодействий
203
несущественно, поскольку для применения выражений из табл. 1 и 2 необходима только концентрация лиганда ms, однозначно определяемая стадией диализа. Ввиду относительно высокой ионной силы (для уменьшения неспецифических взаимодействий) и низкой концентрации растворенного вещества, применяемых в аффинной хроматографии, нет необходимости в поправке Доннана даже для заряженных лигандов.
4. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ МОНОВАЛЕНТНЫХ РАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
Любая из приведенных выше методик эксперимента дает величины /дА и Fa, на основании которых следует определить четыре параметра, а именно две истинные константы равновесия, тх (полную концентрацию доступных положений матрицы) и Va* (объем, доступный для А). Возможность такого определения иллюстрируется результатами [3] зависимого от глюкозы элюирования лизоцима с сефадекса G-100 (пример 3), т. е. к более сложной ситуации, при которой нет возможности непосредственного измерения 1/д* из-за взаимодействия между А и положениями связывания матрицы.
4.1. Полный анализ конкурентной аффинной системы
Результаты экспериментов по распределительному равновесию с системой сефадекс G-100 — лизоцим — глюкоза [3] представлены на рис. 3, который относится к экспериментам с Vs = = 4,44 мл и 1/0 = 7,80 мл. В этих экспериментах ms считалась равной т$, так как полная концентрация фермента в жидкой фазе ша несравнимо меньше (8,3 мкмоль/л), чем концентрация wis глюкозы (0,17-^0,84 моль/л). Прежде всего из рис. З,а виден линейный характер графика, построенного в обратных координатах, что указывает на правильность представления о лизоциме как о моновалентном растворенном веществе в данной системе: этот вывод обоснован в том смысле, что глюкоза, подобно N-ацетилглюкозамину [3], конкурирует, вероятно, с поли-сахаридной матрицей за единственное активное положение молекулы фермента. Обработка графика (рис. 3,а) с помощью линейного регрессионного анализа приводит к (1 + + ^AxmA)2/VA^As/CAxmx-0,30 и (1+ /tAx™A)/VA*/tAxmx = 0,90 (получены по тангенсу угла наклона прямой). Поскольку Fa^Va*_h l/ms-ИЗ, то отсекаемый отрезок соответствует значению 1/(Fa-Va*). Установлено, что (VA—VA*) = Ul мл, Va = -11,73 мл, тА = 8,3 мкмоль/л, откуда VA* = 10,62 мл. Характер графика на рис. 3,6, отражающего зависимость Va от концентрации фермента в отсутствие глюкозы, определяется комбина-
204
Глава 6
0 2 4 6 0 1 2 3
l/ms (л/моль) /Лд, мкмоль/л
Рис. 3. Графическое определение констант равновесия для взаимодействия лизоцима с сефадексом G-100 (Ках) и глюкозой (/(as) с помощью количественной аффинной хроматографии, а — влияние концентрации глюкозы на объем элюирования Va лизоцима в экспериментах с 8,3 мкМ фермента; б — концентрационная зависимость объема элюирования Va для лизоцима в отсутствие глюкозы [3]. (Воспроизведено с разрешения.)
цией двух выражений для отсекаемого на оси ординат отрезка на рис. 3, а, что приводит к зависимости
(Va-V* А) V-аКахшх V*Amx После определения тангенса угла наклона (9,46•1O4) и величины отрезка, отсекаемого на оси ординат (0,079) по графику с одной обратной величиной (рис. 3,6), были получены значения тх=1,0 мкмоль/л и Лах=1,2-106 M"1. В заключение по наклону графика на рис. 3,а можно найти еще один параметр /(as =
-30 м-1.
4.2. Анализ лигандзадерживаемых аффинных систем
До сих пор обсуждение было ограничено ситуацией, при которой распределяющееся растворенное вещество взаимодействует с положениями связывания матрицы (пример 3; также применимо к примеру 4). Теперь кратко рассмотрим примеры, где взаимодействие растворенного вещества с матрицей протекает через образование тройного комплекса. Ситуация, при которой растворимый AS-комплекс взаимодействует со связанными с матрицей Х-положениями (пример 1), по-видимому, более часто
Характеристика взаимодействий
205
встречается в количественной аффинной хроматографии, чем другая возможность (пример 2), при которой S должен вначале взаимодействовать с X с образованием матрицы, содержащей S как ковалентно связанную часть иммобилизованного реагента XS. В любом случае очевидно, что на основании экспериментов в отсутствие лиганда невозможно получить никакие данные, кроме значения 1/А*; поэтому тх надо определять по экспериментальным данным со смесями растворенное вещество — лиганд.
Изучение выражений для примеров 1 и 2 табл. 1 показывает, что для зависимости, построенной в координатах 1/Fa—Va* от 11ms, отношение отсекаемого отрезка к тангенсу угла наклона дает численное значение для произведения Кв(і + Ктіпа), где Kb — константа бинарного равновесия {Kb = KaS для примера 1 либо Kb^=KxS для примера 2), а Кт — константа тройного равновесия, т. е. Kasx (пример 1) или Kxsa (пример 2). Следовательно, определение численного значения того же произведения из второй серии экспериментов, проведенных при других значениях ша, в принципе может привести к получению второго уравнения; располагая двумя уравнениями, можно оценить два параметра Kb и Кт, а затем найти mx- В то же время график в координатах l/(VA—Va*) от гпа может быть использован для определения шх и Kt по наклону и отсекаемому отрезку путем определения зависимости Va от концентрации растворенного вещества ша в ряде экспериментов с достаточно высокой концентрацией лиганда (при очень большом значении KbWs) . Действительно, выражение для лигандзадерживаемой аффинной хроматографии в присутствии насыщающей концентрации лиганда становится формально идентичным используемому [уравнение (3)] для лигандускоряемых систем, причем единственными различиями являются замещение константы тройного равновесия (K\sx или Kxsa) на константу двойного равновесия Ках, a Va — на VA. В настоящее время отсутствуют сообщения об экспериментальных исследованиях сравнительных достоинств этих двух процессов.
