Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
2) 30 мл этого раствора встряхивают с 5 г сухого геля (сепарон НЗОО, содержание эпоксидных групп 600 мкмоль/г), суспензию фильтруют и гель промывают водой, 6,0 M раствором хлорогидрата гуанидина и в заключение водой.
3) Дальнейшую обработку проводят как в разд. 10.1.1. Содержание связанного ингибитора составляет 155 мкмоль/г сухого носителя.
188
Глава 5
10.2. Хроматография пепсина свиньи на колонках с є-аминокапроил-Ь-фенилаланил-О-фенилаланилметил-сепароном с различными концентрациями иммобилизованного ингибитора
Раствор пепсина (1 г/200 мл) в 0,1 M ацетатном буфере (pH 4,5) наносят на колонку (9X0,8 см) с е-аминокапроил-ь Phe-D-Phe-ОСНз-сепароном, полученным, как описано в разд. 10.1, и уравновешенным 0,1 M раствором ацетата натрия (pH 4,5). Колонку промывают уравновешивающим буфером и
Номер фракции
Рис. 18. Аффинная хроматография пепсина свиньи на колонках с є-амино-капроил-L-Phe-D-Phe-OMe-cenapoHOM с низкой (а) и высокой (б) концентрациями иммобилизованного ингибитора [72]. Концентрация ингибитора (мкмоль/г сухого носителя): а — 0,85; б—155. 1 — концентрация белка; 2— протеолитическая активность.
Лиганды для иммобилизации
189
затем десорбируют пепсин 0,1 M ацетатным буфером (pH 4,5), содержащим 1,0 ммоль/л хлорида натрия. Типичные результаты по очистке пепсина свиньи приведены на рис. 18.
IL ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХ ВИТАМИН В*2, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
В работе [73, 74] выделены витамин В^-связывающие белки с использованием аффинной хроматографии на витамин Ві2-сефарозе. Производные витамина B12 можно получить частичным кислотным гидролизом (в 0,4 M HCI в течение 64 ч при комнатной температуре) амидных групп незамещенных пропион-амидных боковых цепей корринового кольца витамина Bt2. Полученная смесь MOHO-, ди- и трикарбоксипроизводных витамина B12 может быть разделена хроматографией на QAE-сефадексе.
11.1. Присоединение производных витамина B12 к 3,3'-диаминодипропиламинзамещенной сефарозе
1) Лиофилизованные производные витамина Bi2 растворяют в воде до концентрации 10,7 мкмоль/мл.
2) Добавляют 30 мл этого раствора и 4,3 мл воды в стакан, содержащий 30 мл (упакованный объем) 3,3'-диаминодипропил-аминзамещенной сефарозы, и перемешивают на магнитной мешалке при 22 0C
3) Увеличивают pH от 3,9 до 5,6 с помощью 0,2 M NaOH (~1,2 мл); добавляют 3,0 мл 1-этил-3-(3-диметиламинопро-пил)-карбодиимида (50 мг/мл) порциями по 0,6 мл с интервалом в 1 мин при постоянном перемешивании.
4) Продолжают осторожное перемешивание при комнатной температуре (22 °С) в темноте в течение 18 ч.
5) Отделяют замещенную сефарозу фильтрованием в вакууме на воронке Бюхнера и тщательно промывают при 22 °С дистиллированной водой (300 мл), ОД M глицин-NaOH (pH 10,0; 600 мл), дистиллированной водой (300 мл) и 0,1 M фосфатом калия (pH 7,0; 300 мл).
Промытая замещенная сефароза темно-красного цвета содержит 0,68 мкмоль витамина Bi2 на 1 мл упакованной сефарозы.
Литература
1. Porath in: Methods in Enzymology, Vol. 34, Jakoby W. B., Wilchek M. (eds.), Academic Press, Inc., London and New York, 1974, p. 13.
2. Gribnau T. C. L, van With T., van Somtneren Roeles F., van Hell H., Schuurs A., INSERM (Colloquium on Affinity Chromatography), 86, 175 (1979).
3. Porath L. Carlsson L1 Olsson /, Belfrage G.t Nature, 258, 298 (1975).
Глава 5
4. Sundaram P. V4 Hornby W. E4 FEBS Lett., 10, 325 (1970).
5. Cuatrecasas P., J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970).
6. Weetall H. H., Nature, 223, 959 (1969).
7. Alebic-Kolbah T., Rendic S., Fuks Z., Sunjic V4 Kajfez F., Acta Pharm. Jugoslav., 29, 53 (1979).
8. Stewart K. K4 Doherty R. F4 Proc. Natl. Acad. Sei USA, 70, 2850 (1973).
9. Lagercrantz C4 Larsson T.f Karlsson Я., Anal. Biochem., 99, 352 (1979).
10. Lagercrantz C4 Larsson Т., Denfors I4 Comp. Biochem. Physiol., 69C, 375 (1981).
11. Alienmark S., Chem. Ser., 20, 5 (1982).
12. Allenmark S4 Bomgren B4 Boren #., J. Chromatogr., 237, 473 (1982).
13. Alienmark S4 Bomgren B4 J. Chromatogr., 252, 297 (1982).
14. Alienmark S4 Bomgren B., Boren H4 J. Chromatogr., 264, 63 (1983).
15. Bristow P. A4 Brittain P. N4 Riley C M4 Williamson В. F., J. Chromatogr., 131, 57 (1977).
16. Allenmark S., J. Biochem. Biophys. Methods., 9, 1 (1984).
17. Allenmark S4 Bomgren B., Andersson S4 Prep. Biochem., 14, 139 (1984).
18. Allenmark S., Bomgren B., Boren H., Lagerstrom P.-O., Anal. Biochem., 136, 293 (1984).
19. Curthoys N. P., Hughey R. P., Enzyme, 24, 383 (1979).
20. Tate S. S., Meister Л., Mol. Cell. Biochem., 39, 357 (1981).
21. Stromme /. H.t Theodorsen L., Clin. Chem., 22, 417 (1976).
22. Lowry O. H., Rosenbrough N. Fan A. L4 Randall R. J4 J. Biol. Chem., 193, 265 (1951).
23. Dulley J. R,, Grieve Р. A4 Anal. Biochem., 64, 136 (1975).
24. Davis B. Ann. N. Y. Acad. Sei., 121, 404 (1964).
25. Prusak E., Siewinski M., Szewczuk Л., Clin. Chim. Acta, 107, 21 (1980).
26. Ouchterlony O4 Acta Pathol. Microbiol., 26, 507 (1949).
27. Szewczuk A.t Baranowski Г., Biochem. Zeit., 338, 317 (1963).
28. Milnerowicz H.t Prusak E4 Siewinski M.t Ziomek E., Kustrzeba-Wojcicka L1 Szewczuk Л., Arch. Immunol. Ther. Exp., 29, 543 (1981).
