Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Описан [61] быстрый метод получения ДНК из Escherichia coli, содержащей плазмиду pBR322, с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном красителе акридиновом желтом.
8. ИММОБИЛИЗАЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ
8Л. Получение \6-(6-аминогексил)-5/-АМР [64]
1) В стеклянную ампулу (155x15 мм) помещают водный раствор (0,6 мл) натриевой соли 5'-монофосфата рибозида 6-меркаптопурина (I, рис. 13) (10 мг, 0,024 ммоля) и 1,6-гек-сандиамина (II, /г = 6) (200 мг, 1,75 ммоля).
2) Запаянную ампулу нагревают в течение ночи (—16 ч) при 85—95 °С; ампула находится в алюминиевом блоке в горизонтальном положении; полнота реакции зависит от отношения поверхности к объему лиганда.
3) Для контроля хода реакции можно использовать спектральный анализ при удобном разбавлении в воде. При протека-
SH H2N (CH2J77NH
О
О
о
CH9o-P-o
о
сн,о-р-о
I
ш
он он
он
он
Рис. 13. Реакция получения Ы6-(6-аминогексил)-5'-АМР.
12—139
478
Глава 5
нии реакции поглощение при 309 нм уменьшается, а при 267 нм увеличивается (рис. 14), что отражает изменение максимума поглощения при щелочных pH при превращении 6-меркаптопури-на в Ы6-алкилзамещенный аминопурин. На завершение реакции указывает отсутствие поглощения при 309 нм. Обычно реакция количественно протекает за 16 ч, хотя в некоторых случаях мо-лЖет происходить и дольше.
16 г
о I—L-1-1-1-і-1_і_
210 230 250 270 290 310 330 Длина волны.нм
Рис. 14. Спектры поглощения при pH 12 5'-фосфата рибозида 6-меркапто-пурина (10 мг) и гександиамина (200 мг) в воде (0,6 мл). / — сразу после растворения; 2 — через 16 ч при 85—95 0C [64].
4) По охлаждении реакционную смесь разбавляют водой (10 мл) и лиофилизуют до получения светло-желтого гигроскопичного остатка.
5) Эту операцию повторяют несколько раз для удаления избытка гександиамина.
6) Полученный светло-желтый остаток растворяют в минимальном объеме воды и наносят при pH 10,0 на колонку (5х X50 мм) со смолой дауэкс 1-Х2 (формиатная форма; 200— 400 меш) при комнатной температуре.
7) Колонку промывают 0,1 M формиатом аммония (pH 7,0) для удаления примесей и затем элюируют нуклеотид линейным градиентом формиата аммония (pH 5,5; 0,11,0 моль/л, суммарный объем элюента 50 мл).
8) Собирают фракции по 1 мл; фракции, поглощающие при 267 нм, объединяют.
9) После лиофилизации остатки формиата аммония удаляют
Лиганды для иммобилизации
179
путем вакуумной возгонки над смесью NaOH и безводного CaCl2 (3:1 масс/масс); выдерживают в этих условиях до постоянной массы.
8.2. Присоединение 1М6-(6-аминогексил)-5'-АМР к сефарозе 4В
1) 10 г (влажной) сефарозы 4В активируют бромоцианом.
2) Гель промывают ледяным 0,1 M №НС03-буфером (pH 10,0) и добавляют к раствору №-(6-аминогексил)-5'-AMP (10 мг) в 0,1 M NaHCO3 (pH 10,0; 5 мл).
3) Суспензию перемешивают в течение ночи на смесителе Коултера при 40C
4) Матрицу тщательно промывают водой, 1 M KCl и вновь водой; хранят в присутствии азида натрия (0,02%-ный масс/об.).
9. ГИДРОФОБНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Гидрофобная хроматография открывает общий систематический путь для очистки как водорастворимых, так и липофиль-ных белков. Метод основан на наличии гидрофобных участков
Seph-C/y
1ин-{сн2)п-н
S.ph- Zn-HH2
J-NH-(CH2)Z7-NH2
Рис. 15. Различные гомологические ряды производных алкил-агарозы (Seph-Cn-X), которые могут использоваться в гидрофобной хроматографии. Дополнительные ряды могут быть образованы при применении других функциональных групп, введении функциональной группы в различные положения углеводородной цепи или получении цепи, содержащей несколько функциональных групп [65].
SePh-Cy7-COOH HJ-NK-(CH2)/,-COOH.
SePh-C77-OH ^j-NH-(CH2J7J-OH
SCPh-C73-CH=CH2 Hj-NH-(CH2»,,-CH=CH2
Seph-C„-C=CH 1IJ-NH-(CH2^-C=CH
Seph-C„-<(H 3 If NH-ICH^-^H 3
на поверхности белков, что приводит к гидрофобным взаимодействиям различной силы с незаряженной матрицей, содержащей гидрофобные группы.
В подходе, описанном ниже, используются гомологические ряды алкил-агароз и их производных (рис. 15) для достижения разделения и очистки белков и клеток [65].
12*
180
Глава 5
9.1. Синтез сефарозы-Сп (п = 1-=-12) CNBr-методом
1) Сефарозу 4В активируют реакцией с CNBr при pH 10,5-ь -5-11,0 и 22 °С.
2) CNBr (1 г в 1 мл диоксана) добавляют к агарозе (10 г влажного носителя), суспендированной в воде (20 мл).
3) Активацию начинают после доведения pH смеси до 11,0 путем добавления 5,0 M NaOH.
4) Проводят реакцию в течение 5 мин при осторожном перемешивании, поддерживая pH 10,5ч-11,0 с помощью 5,OM NaOH,
5) Для прекращения активации добавляют измельченный лед; смесь фильтруют и гель промывают ледяной водой (100 мл).
6) Растворяют соответствующий я-алкиламин (4 моль/моль CNBr, использованного для активации агарозы) в растворителе, состоящем из равных объемов ^№-диметилформамида и 0,1 M NaHCO3 (pH 9,5) (20 мл), и при необходимости доводят pH до 9,5. В случае алкиламинов с длинной углеводородной цепью (л>8) может образоваться гель или осадок; смесь следует нагреть до —600C до получения прозрачного раствора, быстро охладить и смешать с активированной агарозой до повторного появления осадка.
