Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
70 мл мышечного экстракта кролика, содержащего 1,75 г белка с синтетазной активностью 0,2 Е/мг белка, наносят на колонку с Seph-C4-NH2 (2,4X10 см), уравновешенную буфером состава: 50 мМ ?-глицерофосфат натрия +50 мМ 2-меркаптоэта-нол+1 мМ ЭДТА (pH 7,0). После удаления несвязавшихся белков промыванием уравновешивающим буфером применяют линейный градиент NaCl в том же буфере. Гликогенсинтетаза I была очищена этим способом в одну стадию в 20—50 раз. Сильное отличие в поведении этого фермента и гемоглобина на
Лиганды для иммобилизации
183
Seph-C4-NH2 дало возможность выделения гликогенсинтетазы из эритроцитов человека со степенью очистки 600 раз в одну стадию.
9.6. Выбор гомологического ряда аффинных сорбентов
Пробные наборы колонок очень удобны не только для решения вопроса о том, какая колонка в ряду может дать оптимальную очистку, но также и вообще для выбора наиболее подходящего ряда адсорбентов. Исследованиями такого рода удалось найти тактику разделения клострипаина и коллагеназы [68]. Оба фермента имеют очень близкие профили адсорбции в ряду Seph-Cn (п= 1-н7), причем оба сорбируются на Seph-Сб. Однако они имеют различные профили адсорбции в ряду Seph-Cn-NH5; в то время как клострипаин в значительной степени удерживается уже на Seph-C4-NH2, коллагеназа не связывается на этой колонке. В условиях эксперимента для полного удерживания фермента требуется сорбент с более длинной цепью, Seph-c7-NH2. Более того, связывание ферментов на Seph-C4-NH2 и на Seph-C7-NH2 количественно обратимо в обоих случаях при добавлении в элюирующий буфер 1,0 M NaCL
На основании этого предварительного эксперимента становится ясным, что целесообразно разделять два фермента при пропускании неочищенного препарата через Seph-C4-NH2 для извлечения клострипаина и затем выделять коллагеназу хроматографией несвязавшихся белков на Seph-C7-NH2. Указанное последовательное использование двух колонок из ряда Seph-Crt-NH2 дает возможность разделения и очистки обоих ферментов.
9.7. Методы элюирования
Систематические исследования по оптимизации элюирования белков с алкил-агароз выявили множество факторов, влияющих на элюирование; были найдены агенты, понижающие полярность, специфические «деформаторы», мягкие детергенты; кроме того, изучалось влияние концентрации денатурирующих веществ, изменения pH, температуры, ионной силы и состава буфера. Поскольку доступность гидрофобных положений на поверхности белка обусловлена, по-видимому, его конформацией, а удерживание белков на алкилагарозах зависит в основном от липофильности, размера, формы и локализации этих положений, то способы элюирования, описанные выше, могут приводить либо к непосредственному разрушению гидрофобных взаимодействий между адсорбентом и белком, либо к изменению конформации белка, либо к комбинации обоих эффектов.
Высокая селективность элюирования также может быть достигнута при применении биоспецифических лигандов, таких,
184
Глава 5
как коферменты, субстраты, специфические ионы металлов и ал-лостерические эффекторы, которые часто вызывают конформа-ционные изменения в белках.
Гликогенфосфорилазу b можно элюировать с Seph-C6 соединениями, уменьшающими полярность, например этиленгликолем [69]. При увеличении концентрации этого гликоля в элюирую-щем растворителе до 30% (об./об.) фермент десорбируется стой же колонки простым понижением pH элюирующего буфера да 5,6, что, как известно, приводит к определенным структурным изменениям в указанном ферменте. Добавление мочевины (1,0 моль/л) к элюирующему буферу также способствует десорбции фермента. Однако было установлено, что с точки зрения сохранения нативной конформации этого фермента (наивысшей каталитической активности и неизменного ответа на действие регуляторных метаболитов) оптимальным элюентом является 0,4 M имидазолцитрат (pH 7,0).
Термин «деформатор» был введен для соединений, вызывающих локализованное, довольно ограниченное конформационное изменение в белке, полностью и легко обратимое при удалении этого соединения. Разным белкам соответствуют различные специфические реформаторы», и в литературе описаны многочисленные примеры ферментов, которые особенно чувствительны к специфическим катионам, анионам или незаряженным соединениям. Их влияние на структуру фермента часто выражается в обратимой инактивации последнего (изменение значений Кт или Кмакс, или и той и другой величины), в изменении агрега-ционного состояния или констант связывания фермента с определенными лигандами. Такого рода соединения очень часто упоминаются в сообщениях об оптимизации методики определения активности данного фермента и относятся к неконкурентным ингибиторам, которые не должны присутствовать в аналитической пробе. Некоторые из этих соединений могут действовать как специфические «деформаторы», вследствие чего следует провести скрининг с помощью пробного набора для определения их эффективности как элюентов.
9.8. Примеры применения гидрофобной хроматографии
9.8.1. Использование фенил-сефарозы для очистки фактора увеличения колонии лимфоцитов (ФУКЛ) [70].
