Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
зеинкиназа.
гласно опубликованным данным [50, 51], первая фракция, по-видимому, соответствует РНК-полимеразе I, а вторая фракция— РНК-полимеразе II. Это подтверждается порядком элюирования с ДЭАЭ-сефадекса линейным градиентом соли. Соотношение активностей, элюированных при 300 мМ и 600 мМ концентрациях сульфата аммония, также свидетельствует о том, что эти фракции представляют собой нуклеолярную РНК-полимера-зу I и нуклеоплазматическую полимеразу II соответственно.
170
Глава 5
5.7. Концентрирование и хранение ферментных препаратов
При работе по описанным выше методикам должно соблюдаться соотношение аффинного адсорбента к наносимому белку; например, для белковых экстрактов, полученных из 20 г проростков кукурузы, надо брать оптимально 14 г гепарин-сефаро-зы. При использовании меньших количеств белка фермент элюи-руется в слишком разбавленном виде, а при нанесении большего количества белкового экстракта увеличивается продолжительность стадий разделения и имеет место частичная инактивация фермента. При работе в рекомендованных условиях последующее концентрирование фермента не обязательно. Получаемый при этом раствор фермента устойчив и может храниться несколько недель (при —700C) без потери активности; в этом виде раствор фермента непосредственно можно вводить в следующий этап очистки.
При необходимости для концентрирования казеинкиназы можно использовать фильтрационную камеру Amicon с мембраной UM10; полученные препараты надо хранить в виде небольших порций, соответствующих содержанию белка 0,5-;-1,0 мг/мл, при охлаждении в жидком азоте.
5.8. Регенерация и хранение аффинных адсорбентов
Указанные выше аффинные матрицы могут использоваться несколько раз без заметной потери связывающей емкости, при этом прочно удерживаемые примеси можно удалить путем промывания колонки по следующей схеме:
1) 2,0 M сульфат аммония (2 объема);
2) 1,0 M трис(рН 8), содержащий 6,0 M мочевину (3 объема);
3) дистиллированная вода (5 объемов).
Аффинные матрицы хранят при 4 °С в уравновешивающем буфере, содержащем азид натрия (0,02% масс/об.).
5.9. Замечания по экспериментальным методикам
Все стадии экстракции ферментов, очистки и концентрирования должны проводиться при 2—4 °С. Ввиду нестабильности восстанавливающих агентов, монотиоглицерина и меркаптоэтано-ла, их следует добавлять в буферы непосредственно перед использованием. CNBr-активированная сефароза 4В неустойчива и должна немедленно вводиться в реакцию конденсации с ли-гандами. ot-Аманитин— чрезвычайно токсичное соединение и при работе с ним должны быть приняты специальные меры предосторожности. Особое внимание следует обратить на соблюдение
Лиганды для иммобилизации
171
рекомендованных значений ионной силы растворов препаратов, наносимых на аффинные колонки, поскольку этот фактор критический для разделения и очистки ферментов.
С. ПРИСОЕДИНЕНИЕ ж-АМИНОФЕНИЛБОРНОЙ КИСЛОТЫ К ТРИАЗИНАКТИВИРОВАННЫМ НОСИТЕЛЯМ
С целью нахождения оптимальных условий реакции присоединения ж-аминофенилборной кислоты (АФБК) к триазинакти-вированным агарозным шарикам изучено применение четырех различных буферов [55]. Приведем описание используемой методики.
Влажный активированный гель (2 г) суспендируют в буфере (2 мл) и добавляют к суспензии буфер (4 мл), содержащий 0,1 M АФБК. Суспензию перемешивают при комнатной темпе-
рне. 12. Изменение во времени степени присоединения ж-аминофенилборной кислоты к триазинактивированному гелю матрекс. Растворы для присоединения: 1 — 10 мМ NaOH; 2 — 0,5 M калийфосфат (pH 7,5); 5 — 0,5 M трис-HCl (pH 8,8); 4 — 0,5 M натрийбикарбонат— карбонат (pH 10,25).
ратуре на смесителе Коултера, отбирают через определенные промежутки времени аликвоты, которые промывают и анализируют на содержание бора. Результаты представлены на рис. 12. При осуществлении реакций присоединения аминосодержащих лигандов к различным типам активированных носителей для обеспечения нуклеофильной атаки аминогруппы в незаряженной форме на активированную матрицу во многих работах рекомендуется использовать буферы с высоким pH. Однако, поскольку рКа ароматических первичных аминогрупп гораздо ниже, чем у
2,0-
? 3 A4
О 10 20 30 40 50
Время, Ч
172
Глава 5
алифатических аминогрупп, присоединение АФБК к триазинак-тивированным гелям можно проводить в более мягких условиях. Результаты, приведенные на рис. 12, свидетельствуют о том, что присоединение протекает быстро при высоком pH (10 мМ NaOH), но в равной степени быстро и при более низких pH (фосфат калия, pH 7,5). Интересна также медленная реакция, наблюдаемая в бикарбонатном буфере (pH 10,25), поскольку многие исследователи рекомендуют использовать бикарбонат-ные буферы для иммобилизации различных лигандов к активированным гелям разных типов. Широкое распространение получило представление о том, что специфические условия присоединения, пригодные для одного конкретного случая, будут столь же хороши для других. Однако приводимые здесь результаты свидетельствуют совсем о другом.
Присоединение в трис-HCl (pH 8,3) протекает со средней скоростью, но в итоге гель содержит столько же бора, сколько и в случае проведения конденсации в NaOH или фосфатном буфере. Следовательно, сам трис не реагирует с активированным гелем. Это может быть, кроме того, продемонстрировано отсутствием реакции после 18-часовой инкубации активированного геля в 2,0 M трисе при pH 10,0 и 60 °С. На геле до и после обработки иммобилизуются равные количества алифатического диамина, и общее содержание азота в геле не меняется после инкубации. Было обнаружено, что родственное соединение, 2-амино-2-метил-1,3-пропандиол, также не реагирует с триазинактивиро-ванными гелями. Структурные модели этих двух соединений указывают на то, что в наиболее стабильной форме атом азота стерически экранируется гидроксиметильными группами, которые могут сильно уменьшать его нуклеофильность. Для демонстрации этого факта можно показать, что ни один из этих двух аминов не реагирует с нингидрином с образованием синего продукта. По этим причинам вполне вероятно, что трис в равной степени не будет реагировать и с другими активированными матрицами различных типов и, таким образом, без всяких проблем может быть использован в буферах для присоединения лигандов. В действительности широко распространено мнение о нежелательности использования триса в растворах для присоединения лигандов, и очень часто трис рекомендуется в качестве удобного реагента для блокирования остающихся после иммобилизации лиганда активных групп.
