Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Фракция иммуноглобулинов G (IgG) может быть выделена из антисыворотки по методике, описанной ниже [30].
154
Глава 5
1) Сыворотку доводят до 50%-ного насыщения сульфатом: аммония (31,3 г на 100 мл).
2) Через 1 ч осажденный белок отделяют путем центрифугирования (10000 ? в течение 60 мин) и растворяют в небольшом объеме 10 мМ фосфата калия (pH 6,8).
3) Перед добавлением соли доводят объем раствора до первоначального объема антисыворотки и проводят повторное осаждение фракции иммуноглобулинов путем добавления твердого* сульфата аммония до 50%-ного насыщения.
4) Осажденный белок растворяют в небольшом объеме 10 мМ фосфата калия (pH 6,8) и проводят диализ раствора против 100 объемов 10 мМ фосфата калия (pH 6,8), трижды заменяя буфер.
5) Для дальнейшей очистки образец пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (DE-52, Whatman), предварительна уравновешанной 10 мМ фосфатом калия (pH 6,8), используя 5—8 мл упакованной целлюлозы на 1 мл фракционируемой антисыворотки.
6) Промывают колонку уравновешивающим буфером и собирают фракции. IgG не задерживается на колонке с целлюлозой; IgG-содержащие фракции идентифицируют по поглощению при 280 нм, принимая поглощение 0,1%-ного раствора при длине кюветы 1 см за 1,45. Фракции с концентрацией IgG>0,5 мг/мл объединяют и концентрируют (по крайней мере в 30 раз) путем ультрафильтрации. Полученные таким образом препараты антител можно хранить при —200C без значительной потери иммунологической активности в течение нескольких месяцев. Используя эту методику, можно получать 400—600 мг IgG из одного кролика.
4.4. Получение иммуноадсорбентов. Общая методика
Иммуноадсорбент может быть получен иммобилизацией полученного по вышеописанной методике препарата антител на CNBr-активированной сефарозе [31].
1) 10 г суспензии сефарозы 4В (Pharmacia, Швеция) промывают три раза дистиллированной водой на стеклянном фильтре, затем переносят в химический стакан и суспендируют в 2,0 M карбонате натрия (10 мл) путем перемешивания на магнитной мешалке (вытяжной шкаф\).
2) Сразу добавляют раствор бромоциана (1 г в 1 мл ацето-нитрила) и энергично перемешивают 2 мин при комнатной температуре.
3) Переносят суспензию на фильтровальную воронку и быстро промывают с отсасыванием ледяной деионизованной водой (100 мл) и затем 0,25 M карбонатным буфером (pH 9,5; 100 мл).
4) Гель быстро переносят в колбу (50—75 мл), содержащую
Лиганды для иммобилизации
155
150 мг антител в 0,25 M карбонатном буфере (pH 9,5; 10 мл).
5) Для поддержания геля в суспендированном состоянии осторожно встряхивают колбу при 4 °С в течение 16 ч.
6) Гель отфильтровывают и промывают карбонатным буфером, содержащим 0,5 M NaCl; для разрушения оставшихся активных групп гель выдерживают в трис-НС1-буфере (pH 8,6; 50 мл) в течение 2 ч при комнатной температуре*.
7) Вновь промывают гель 0,25 M карбонатным буфером, содержащим 0,5 M NaCl, и затем NaCl-натрийфосфатным буфером, содержащим азид натрия (0,02% масс/об.). Гель можно хранить при 4 °С в течение нескольких недель без заметного уменьшения активности иммобилизованных антител.
4.5. Очистка GGT (легкая форма) из тканей животных
Метод основан на расщеплении под действием бромелаина твердого остатка, полученного после центрифугирования при 100000g тканевого гомогената; полученный таким образом растворимый фермент далее очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке со специфическим иммуноадсорбентом.
4.5.L Растворимый препарат GGT (легкая форма). Свежие ткани (почки, печень, гепатома) крыс и мышей получают после де-капитации животных. Ткани быка получают со скотобойни. При —20 °С ткани можно хранить в течение нескольких месяцев без потери GGT-активности,
1) После оттаивания ткани пропускают через мясорубку и гомогенизируют с холодным NaCl-натрийфосфатным буфером в гомогенизаторе Waring Blendor, используя 4 объема буфера на объем ткани.
2) Жидкую кашицу центрифугируют (300Og*) в течение 15 мин и осадок отбрасывают; остаток кашицы вновь центрифугируют (100000 g) при охлаждении в течение 60 мин.
3) Отделенный твердый остаток суспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 1 ммоль/л ЭДТА ( — 5 объемов).
4) Доводят концентрацию белка в суспензии до —20 мг/мл путем добавления фосфатного буфера, содержащего ЭДТА, и прибавляют 2-меркаптоэтанол до концентрации в конечном растворе 10 ммоль/л.
5) Добавляют бромелаин (Sigma, удельная активность 2310 Е/мг) в количестве 1 мг на 10 мг белка и инкубируют сус-
* Маловероятно, чтобы обработка геля трис-НС1-буфером (pH 8,6) в указанных условиях обеспечивала полное разложение или блокирование активных групп на сефарозе (см., например, далее разд. 6). Целесообразнее блокировать остаточные активные группы стандартной обработкой геля I M этаноламином (pH 8-=-9). — Прим. перев.
156
Глава 5
пензию при 37 0C: для солюбилизации GGT из почек и гепатомы в течение 3 ч; для солюбилизации GGT из печени быка в течение 15 ч.
6) Полученную суспензию центрифугируют (10000Og-) в течение 60 мин. Жидкую фазу после центрифугирования, которая содержит солюоилизированную GGT, можно хранить до дальнейшей очистки при —30 °С.
