Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
2) Присоединение пепсина. Активированную агарозу (50 мг) в небольшом сосуде, соединенном с pH-метром для автоматического поддержания pH, суспендируют в 4 мл дистиллированной воды; добавляют 25 мкл ацетальдегида, 10—25 мг пепсина и 25 мкл изоцианида. Поддерживают pH 5,8 с помощью автоматического pH-метра (Radiometer, Копенгаген) в течение 6 ч. Промывают продукт на стеклянном фильтре G3 водой и затем в небольшой колонке следующими буферами: 0,1 M натрийцит-ратным буфером с 1,0 M NaCl (pH 4,0; 48 ч); 0,1 M натрийацетатным буфером с 1,0 M NaCl (pH 5,4; 24 ч) и в заключение 0,01 M натрийцитратным буфером (pH 4,0). Хранят продукты при 4 °С в 0,01 M цитрате натрия (pH 4,0), содержащем азид натрия (0,02% масс/об).
2.6. Иммобилизация аспартатаминотрансферазы
CNBr-активированную сефарозу 4В (0,5 г влажного носителя) смешивают с 1,0 мг аспартатаминотрансферазы, растворенной в 0,1 мл 0,05 M трис-НС1-буфера (pH 7,0). Реакцию присоединения проводят в течение 16 ч при 4 °С. Иммобилизованный фермент тщательно промывают 0,1 M калийфосфатным буфером с pH 8,5 и затем буфером с pH 5,5.
2.7. Иммобилизация триптофаназы
CNBr-активированную сефарозу (10 мл) смешивают с 40 мг триптофаназы, растворенной в 0,1 M калийфосфатном буфере (pH 7,0; 5,0 мл). Смесь осторожно перемешивают в течение 24 ч при 4 0C В результате этой реакции —80% исходного количества белка иммобилизуется на сефарозе. Препарат иммо-
142_ Глава 5
билизованного фермента при использовании в непрерывных фер[ ментативных реакциях в течение 5 сут при 370C теряет за это/г период лишь —3% ферментативной активности.
2.8. Присоединение IgG кролика к гидразидным шарикам
Полистирольные шарики, содержащие гидразидные группы, поставляются фирмой Pierce Chemical Co.
1) К 4 г гидразидных шариков ( — 25 мл) прибавляют 5 мл 12,5%-ного раствора глутарового альдегида (2,5 мл 25%-ного раствора глутаральдегида разбавляют до 5 мл 0,1 M фосфатом натрия с pH 7,0).
2) Смесь встряхивают очень осторожно в течение 2 ч при комнатной температуре.
3) Промывают 100 мл воды на воронке Бюхнера (без фильтровальной бумаги), а затем 0,1 M фосфатом натрия (pH 6,0; 20 мл).
4) К раствору кроличьего IgG (2,5 мг в 5 мл 0,1 M фосфата натрия, pH 6,0) добавляют глутаральдегидактивированные шарики.
5) Добавляют 1 мг цианоборогидрида натрия (на этой стадии образованные выше шиффовы основания восстанавливаются до стабильных вторичных аминов).
6) Рекционную смесь осторожно встряхивают при комнатной температуре в течение ночи.
7) Полистирольные шарики с присоединеннным IgG промывают 0,1 M фосфатом натрия (pH 6,0; 50 мл), а затем 0,1 M бикарбонатом натрия (100 мл).
8) Полистирольные шарики с иммобилизованным IgG добавляют к 0,1 M бикарбонату натрия (5,0 мл), содержащему боро-гидрид натрия ( — 1 мг).
9) Смесь осторожно встряхивают в течение 15 мин (на этой стадии восстанавливаются непрореагировавшие с белком альдегидные группы).
10) Шарики с иммобилизованным IgG промывают 0,1 M карбонатом натрия (100 мл) и затем водой (100 мл).
11) IgG-содержащие шарики подсушивают на фильтровальной бумаге и хранят в сухом виде при 4°С,
2.9. Использование колонок с силикагелем, содержащим иммобилизованный бычий сывороточный альбумин, для оптического расщепления методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
С. Алленмарк, 5. Бомгрен (S. Allenmark, В. Bomgren)
Ниже приведены методики по применению колонок, упакованных БСА-силикагелем, в ВЭЖХ для аналитического расщепления некоторых рацемических веществ на энантиомеры. Для
_Лиганды для иммобилизации_143
(^следователей, имеющих доступ к необходимому оборудованию желающих изготовить собственные колонки, включено также описание методики упаковки колонок. После общего обзора метода ВЭЖХ и возможностей его применения приведены конкретные экспериментальные методики оптического расщепления ряда органических соединений. В заключение приведен перечень соединений, расщепленных к настоящему времени этим методом.
2.9.L Введение. Сывороточные альбумины обычно относят к транспортным белкам организма, и исследование их связывающих свойств, т. е. «сродства» к различным эндогенным соединениям и лекарствам, вызывает интерес многих фармакологов и биохимиков. Исследование равновесия в растворах продемонстрировало энантиоселективные свойства альбуминов [7], но изучение возможностей, которые открывает применение этих свойств в хроматографии, началось лишь в самое последнее время [8— 13]. Метод с использованием белка, такого, как бычий сывороточный альбумин (БСА), в качестве стационарной фазы в жидкостной хроматографии может быть отнесен к «обращенной» аффинной хроматографии, поскольку в этом случае иммобилизованным компонентом является белок, а не соответствующий низкомолекулярный лиганд. Первые работы с БСА, присоединенным к агарозе, в пластмассовых или стеклянных колонках и с использованием перистальтического насоса для подачи подвижной фазы дали возможность синтезировать в дальнейшем хроматографический материал для ВЭЖХ на основе силикагеля с размером частиц 10 мкм [14] (Resolvosil Юц-БСА поставляет фирма Macherey-Nagal GmbH, ФРГ).