Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
1) Агарозные (4%-ные) шарики (40 г влажного геля) промывают и суспендируют в ледяной воде (60 мл).
2) Добавляют бромоциан (9 г), растворенный в воде (135 мл), и доводят pH до 11,5. Этот pH при необходимости поддерживают путем добавления концентрированного раствора КОН.
3) Через 20 мин агарозу отделяют путем фильтрования и промывают ледяным 0,1 M калийфосфатным буфером (pH 8,0; 600 мл).
4) Промытую агарозу суспендируют в 40 мл того же буфера, -содержащего поли(U) (20 мг).
5) Смесь составляют при 4 °С в течение 18 ч, промывают 90%-ным (об./об.) формамидом (200 мл) в 10 мМ фосфате калия, 10 мМ ЭДТА (pH 7,5; 200 мл) и затем еще 200 мл 25%-ного (об./об.) формамида в 50 мМ трис-HCl, содержащем 0,7 M NaCl и 10 мМ ЭДТА (pH 7,5).
1.8. Получение ДНК, иммобилизованной на агароза-акриламидной матрице
1) ДНК (60 мг) растворяют в 0,05 M трис-HCl (pH 7,8; 100 мл), содержащем акриламид (9,7 г) и ІМ^'-метиленбисак-риламид (0,3 г).
2) Смесь охлаждают до 15 °С и добавляют N.N.N'N'-TeTpa-метилэтилендиамин (0,8 мл).
3) Раствор акриламид-ДНК выливают в равный объем 1%-ного (масс/об.) раствора агарозы при 5O0C, смесь быстро перемешивают и добавляют при перемешивании раствор персульфата аммония (0,15 г) в минимальном объеме воды.
4) Выдерживают смесь 30 мин; гель разрезают на кубики объемом 1 см3, а затем эти кубики продавливают через сетку ив нержавеющей стали для получения мелких частиц.
Лиганды для иммобилизации
135
2. БЕЛКИ
В гл. 3 уже была описана иммобилизация гонадотропина хориона человека (ГХЧ) путем активации реакционноспособным азокрасителем. Этим же методом Грибнау и сотр. иммобилизовали также другие белки, например анти-ГХЧ кролика и анти-(кроличий IgG) барана.
2.1. Иммобилизация альбумина и IgG на агарозе
2J.L Иммобилизация на агарозе через бромоциановую активацию.
1) Агарозный гель (10 г потрескавшейся на фильтре, но еще влажной агарозы) суспендируют в 0,1 M NaHCO3 (10 мл) и доводят pH до 11,0 путем добавления 4,0 M NaOH.
2) Температуру доводят до 18±1°С путем добавления в смесь измельченного льда.
3) Постепенно в течение 2—3 мин прибавляют при постоянном осторожном перемешивании на магнитной мешалке твердый CNBr (1,0 г).
4) Поддерживают pH 11,0±0,1 путем добавления 4,0 M NaOH; температура 18±1°С. Продолжительность активации 12 мин.
5) Активированный гель промывают поочередно ледяными 0,1 M NaHCO3 и 5%-ным (об./об.) ацетоном; для заключительного промывания надо использовать 0,1 M NaHCO3.
2.1.2. Реакция присоединения.
1) К гелю добавляют раствор присоединяемого белка в 10— 20 мл буфера для присоединения, например в буфере состава 50 мМ фосфат натрия (pH 7,4), содержащий 0,1 M NaCl, и перемешивают суспензию на роторном смесителе Coulter в течение 24 ч при 4 0C
2) Гель тщательно промывают дистиллированной водой, а затем поочередно 0,1 M ацетатом натрия (pH 4,0), содержащим 0,5 M NaCl, и буфером для присоединения, используемом для растворения белка, с целью удаления электростатически связанного белка.
3) Непрореагировавшие активные группы блокируются путем добавления 0,5 M этаноламина/HCl (pH 9,0).
2.2. Иммобилизация белков на эупергите С (оксиран-акриловые шарики). Общая методика
1) Сухие шарики эупергита С (4 г) помещают в 15 мл раствора белка (70 мг) в буфере для присоединения и оставляют в течение 2 сут при комнатной температуре.
136
Глава 5
2) Удаляют неприсоединившийся белок промыванием на пористом фильтре дистиллированной водой, 1,0 M NaCl и вновь водой.
3) Оставшиеся активные группы блокируют, для чего готовят суспензию шариков в 5%-ном (масс/об.) растворе меркап-тоэтанола с pH 8,0 (доводится 0,5 M NaOH) и перемешивают в течение 1 сут при комнатной температуре.
4) Интенсивно промывают шарики дистиллированной водой и затем буфером для присоединения (pH 7,4).
Обработка меркаптоэтанолом приводит к электронейтральному и гидрофильному сорбенту. Избыток оксирановых групп может быть блокирован другими реагентами, такими, как 2-амино-этанол, а также глицин и тиоуксусная кислота, каждый из которых вводит в матрицу ионизуемые группы.
2.2.1. Иммобилизация трипсина на эупергите С.
1) Готовят раствор трипсина (150 мг) в 1,0 M калийфосфат-ном буфере (pH 7,0), содержащем 0,05% этилового эфира п-гидроксибензойной кислоты (4 мл).
2) Этот раствор добавляют к 1 г эупергита С (масс/об).
3) Смесь хорошо перемешивают и оставляют без перемешивания при комнатной температуре (23 °С) в течение 72 ч.
4) Продукт тщательно промывают, как описано выше в разд. 2.2.
5) Хранят при 5 °С в виде суспензии в фосфатном буфере (0,01 М, pH 7,5), содержащем 0,05% (масс/об.) этилового эфира /г-гидроксибензойной кислоты.
2.2.2. Определение активности трипсина, иммобилизованного на эупергите С. Активность трипсина, иммобилизованного на эупергите С, может быть определена с использованием pH-метра, который должен быть оборудован автоматической бюреткой и контролируемой pH-электродом ячейкой для титрования, что позволяет осуществлять непрерывное титрование до установленной конечной точки (т. е. требуемого pH). Одновременно регист- -рируется количество NaOH пошедшего на титрование; результаты представляются графически в виде зависимости от времени.
