Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
11) Измеряют манометром перепад давления потока через-слой сорбента. Все измерения проводят при 20 °С.
12) Определяют активность и чистоту трипсина с использованием хлорогидрата л-нитроанилида бензоиларгинина № хлорогидрата л-нитрофенил-/г'-гуанидинобензоата.
9.2. Результаты и обсуждение
9.2.1. Максимальная поверхностная скорость. На рис. 12 представлены результаты эксперимента на колонках с внутренним диаметром 1,44 и 10,0 см, снабженных цилиндрическими перегородками высотой 9 см или без них. При увеличении скорости жидкости перепад давления увеличивался, а высота слоя сорбента уменьшалась. По достижении определенной скорости жидкости перепад давления быстро увеличивается ввиду уплотнения шариков сефарозы. Максимальная скорость для колонки диаметром 1,44 см была выше, чем для колонки диаметром 10,0 см без перегородок, и почти равной скорости для 10,0 см колонки с набором коаксиальных перегородок (диаметр 2Д 5,0 и 7,5 см).
Введение перегородок оказывает заметное влияние на кривые элюирования (рис 13). Кривые элюирования для 10,0-см колонки с перегородками (диаметр 2,5, 5,0 и 7,5 см) совпадал» с кривыми элюирования для 1,44-см колонки. В то же время элюирование трипсина с 10,0-см колонки без перегородок было более продолжительным.
Увеличение диаметра немодифицированных колонок приводит к уменьшению максимальной скорости жидкости и ушире-нию пиков проскока и элюирования ввиду уплотнения шариков сефарозы. Однако эти недостатки исключаются при введении в колонку коаксиальных цилиндрических перегородок.
10. ИЗГОТОВЛЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ мини-колонок ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Р. Уолтере (R. R. Walters)
Благодаря высокой селективности метода аффинной хроматографии прекрасное разделение могут обеспечить даже очень короткие колонки. Для отдельных простых экспериментов вполне пригодны обычные химические пипетки и другие самодельные колонки, однако для быстрой и чувствительной аналитиче-
Методики эксперимента
125
ской работы необходимы специальные колонки для высокоэффективной аффинной хроматографии (ВАФХ), которые обеспечивают сведение к минимуму уширения пиков и возможность-работы под умеренным давлением.
10.1. Изготовление колонок
Арматуру колонки (фитинги) изготавливают для стальных колоночных трубок с наружным диаметром 0,25" и для соединительных трубок с наружным диаметром 0,0625". В лаборатории автора были изготовлены колонки длиной от 2 мм до 10 см. Концевые фитинги могут быть сделаны из стали или дельрина;. последний легче подвергается обработке и, кроме того, может выдерживать давление до 5000 ат.
Детали конструкции колонки схематически изображены нарис. 14. Впускные и выпускные концевые фитинги / изготавливают из трубок (гексагональной формы; диаметр 0,75") из нержавеющей стали 304 или дельрина. Соединения для впускной, и выпускной трубок делают под фитинги 0,0625" с резьбой 10/32 (2), например фитинги фирм Swagelok или Parker. Отверстие диаметром 0,0625" соединяется с отверстием 4 диаметром 0,0135" с конусообразным отверстием диаметром 0,08" и глубиной 0,015" (4). Выемка 9 глубиной 0,160" служит для вынимания фритт 5 и О-колец 8.
Концевые фитинги соединены друг с другом гексагональным латунным соединением (диаметр 0,75") длиной на ~0,5" больше, чем длина заготовки для колонки. Латунный соединитель и= концевые фитинги имеют диаметр 0,625" с резьбой 32. Заготовка для колонки 7 из нержавеющей стали (316 low RMS) с наружным диаметром 0,25" (Alltech, США) вырезается и обрабатывается на токарном станке.
Затворы образуются двумя фриттами с наружным диаметром 0,25" (5) (Alltech), заполненными фтороуглеродом, причем их диаметр соответствует внутреннему диаметру колонки. В желобок в выпускном концевом фитинге вставляется каучуковое О-кольцо 8 размером 0,25" (внутренний диаметр) Х0,0625". О-кольцо удерживает колонку в выпускном концевом фитинге,, но не является частью затвора высокого давления.
Латунный соединитель 6 может быть использован в качестве водяной рубашки после присоединения медных трубок (диаметр 0,5") к любому концу соединителя. Резьба соединителя также должна быть снабжена уплотняющим материалом.
10.2. Упаковка колонки
Частицы диаметром 10 мкм обычно упаковываются в колонку суспензионными методами под высоким давлением [47, 48]. Многие биохимические лаборатории не имеют необходимого
Рис. 14. Детали конструкции колонки: а —сечение по оси концевых фитингов, колонки и фритт в разобранном виде;
б_вид сбоку впускного концевого фитинга; в — поперечное сечение впускного и выпускного концевых фитингов.
Все размеры даны в дюймах. Впускной и выпускной концевые фитинги имеют одинаковые размеры; различия
указаны. Другие подробности приведены в тексте.
Методики эксперимента
І2Г
для этих целей оборудования, поэтому ниже приводится описание еще двух других методов изготовления коротких колонок,, эффективность которых сравнима с таковой для колонок, приготовленных суспензионным методом.
В любом методе упаковки колонок важно удалить из упаковываемого материала слишком мелкие и слишком большие частицы. Для удаления мелких частиц материал суспендируют в буфере, кратковременно обрабатывают ультразвуком и после оседания основной массы упаковываемого материала сливают жидкость вместе со взвесью мелких частиц. Большие частицы, например агломераты сорбента и пыли, можно удалить либо* путем отделения материала, который оседает первым, либо путем пропускания суспензии упаковываемого материала через мелкое сито (40 мкм).
