Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
1-—і—~-1-1-Ji—і
0 1 2 3 16
бремя инкубации,ч
Рис. 3. Влияние времени инкубации на емкость Ыв-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозы по лактатдегидрогеназе в условиях бетч-процесса [6]. (Воспроизведено с разрешения.)
Методики эксперимента
107
личение процента связывания фермента в начальный период времени с последующим плавным ростом до 100%-ного связывания, причем время 50%-ного связывания составляет 20 мин. При изучении адсорбента в колоночных условиях при более низкой концентрации лиганда наблюдается аналогичное влияние времени уравновешивания. Когда глицерокиназа и лактат-дегидрогеназа уравновешиваются с адсорбентом в течение 67 ч,
СО
* J-1-1-1-1-1-1-і Q
пГ 0 10 20 30 40 50 60
о Скорость потока, мл/ч
ъ
ей
Рис. 4. Связывание лактатдегидрогеназы с №-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефа-розой в зависимости от скорости потока. Образец фермента (100 мл), содержащий 5 E лактатдегидрогеназы и 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина, наносили на колонку (34X5 мм) с N8- (6-аминогексил) -5'-АМР-сефа-розой (0,95 г влажного носителя, 0,125 мкмоль 5'-АМР/мл). / — изменение ширины пика (10"1, мл) в зависимости от скорости тока, определенное по основанию пика; 2—высота (мм), эквивалентная теоретической тарелке, измеренная, как описано в работе [6]; 3— прочность связывания ? оценивалась, как указано в подписи к рис. 1 [6]. (Воспроизведено с разрешения.)
то эффективность колонки и прочность связывания фермента увеличиваются со временем. В случае глицерокиназы также увеличивается процент связывания фермента. Было также изучено влияние скорости потока на связывание лактатдегидрогеназы с N6-(6-аминогексил) -5'-АМР-сефарозой в колоночном процессе. Из рис. 4 видно, что эффективность колонки, оцениваемая как высота, эквивалентная теоретической тарелке, а также прочность связывания фермента уменьшаются при высоких скоростях потока. Влияние скорости потока сильнее проявляется на коротких колонках, где часть ферментативной активности элюируется в исключающемся объеме. Концентрация инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) не оказывает влияния даже при высоких скоростях потока (67 мл/ч).
108
Глава 4
Меньший эффект скорости потока наблюдается для пленочных носителей (рис. 5) [7]. Влияние скорости потока также менее заметно в случае взаимодействий лиганд — макромолекула с высокими константами ассоциации. Однако в некоторых системах с высоким сродством (например, иммуноглобулин — антиген) может иметь место необратимое связывание, если белки контактировали с гелем в течение длительного времени. Как правило, с колонкой следует работать настолько быстро, на-
10 20
Скорость потока,мл/ч
Рис. 5. Зависимость емкости от скорости потока для пленочных носителей по сравнению с таковой для агарозы. 1-т-З — лиганды иммобилизованы на матрексе 201 R; 4-~5—лиганды иммобилизованы на сефарозе. Ферменты: І, 4—дигидрофолатредуктаза из Lactobacillus casei; 2 и 5 — изоцитратде-гидрогеназа из сердца свиньи; 3 и 6 — глутаматдегидрогеназа из Neurospo-ra crassa [7]. (Воспроизведено с разрешения.)
сколько позволяет константа ассоциации системы Ka- Как отмечено выше, влияние времени инкубации на процесс адсорбции легко изучать в бетч-процессе. На рис. 3 представлена зависимость емкости N6- (6-аминогексил) -5'-АМР-сефарозы по лактатдегидрогеназе от времени инкубации в условиях бетч-процесса. Для получения этих данных можно предложить следующую методику эксперимента [6].
1) Влажную N6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозу (0,5 г; 1,5 мкмоль S'-AMP/мл) суспендируют в 10 мМ калийфосфат-КОН-буфере (pH 7,5; 100 мл), содержащем лактатдегидроге-назу (10 E фермента из сердца свиньи).
2) Смесь инкубируют в условиях бетч-процесса на роллер-ном смесителе при 4,5 °С.
3) Через определенные интервалы времени роллер останавливают, дают гелю осесть (15 мин) и отбирают пробу.
4) Определяют активность лактатдегидрогеназы, измеряют .объем жидкой фазы над гелем и рассчитывают количество свя* завшегося фермента.
Методики эксперимента
109
6. ВЛИЯНИЕ pH И ТЕМПЕРАТУРЫ
Значительное влияние на многие биоспецифические взаимодействия оказывает изменение pH и температуры. В случаях когда связывание фермента проявляет заметную рН-зависи-мость (не совпадающую с pH-оптимумом активности), можно ожидать, что кривые элюирования с аффинной колонки будут обнаруживать эту pH-зависимость.
Подобная взаимосвязь наблюдается и при исследовании влияния температуры. Гидрофобные взаимодействия ослабляются при понижении температуры, в связи с чем при наличии на сорбенте гидрофобных вставок изменение температуры может вызывать соответствующие изменения в силе взаимодействия выделяемого биополимера с сорбентом. При необходимости можно использовать сверхнизкую температуру [8, 9].
7fl SiO 9,0 IQP UP
Рис. 6. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы с 6-аминогексано-мл-МАО-сефарозой (/) и N6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозой (2) [10]. (Воспроизведено с разрешения.)
6.1. Влияние pH
Изучение влияния pH и температуры проведено на адсорбентах, специфичных к группе ферментов {10, 11]. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы с двумя аффинными адсорбентами представлено на рис. 6. Взаимодействие фермента с обоими адсорбентами явно не зависит от концентрации ионов водорода в растворе вплоть до pH 8, но в более щелочной области наблюдалась зависимость от природы адсорбента. В случае 6-аминогексаноил-ЫАО+-сефа-розы поведение фермента характеризовалось кажущейся константой p/Ca8,5, в то время как для n5- (6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозы р/С» 9,7. Различия между значениями кажущихся констант р/С, определенных для двух иммобилизованных
