Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 42

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 106 >> Следующая

70 2,52 100 4,40 100 7,80 100
100 3,66 100 5,80 100 10,70 10О
150 5,60 100 7,80 100 15,00 100
200 6,70 100 10,80 86 19,00 100
300 11,0 93 15,50 19 28,0 100
400 12,70 69 17,50 9 35,20 100
500 14,60 14 21,20 0 41,40 100
550 16,50 0 Не исследо- Не исследо- Не исследо- Не исследо-
валось валось валось валось
750 19,00 0 19,50 0 53,00 87
1000 22,30 0 35,5 0 64,00 83
Методики эксперимента
113
Ниже описана методика эксперимента, показывающего влияние соли на связывание глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы из-Leuconostos mesenteroides на колонке с гелем матрекс оранжевый В в трех буферах (трис-НС1, триэтаноламин/NaOH и фосфатный) при различной ионной силе [18].
1) Упаковывают несколько колонок (1 мл, 2,3X0,7 см) с иммобилизованным красителем (концентрация лиганда 5,5 мг/г геля) и уравновешивают их буферными растворами различной концентрации (табл. 1) (pH 7,8; ионная сила меняется в интервале 10 ммоль/л-^-1,0 ммоль/л).
2) На каждую колонку наносят 100 мкл (5,5 E) очищенного фермента (184 Е/мг), диализованного против соответствующего буфера.
3) Промывают колонку уравновешивающим буфером (5 мл) и собирают элюат в виде одной фракции.
4) Связавшийся фермент элюируют во вторую фракцию при промывании колонки уравновешивающим буфером, содержащим 1,0 M KCl (5 мл); также собирают элюат в одну фракцию.
5) Определяют ферментативную активность каждой фракции и рассчитывают степень связывания фермента (в процентах).
8. МЕТОДЫ ДЕСОРБЦИИ
8.1. Конкурентное элюирование лигандом
Большинство замечаний относительно элюирования свободным лигандом касаются также ингибиторов и аллостерических модификаторов. Для проведения конкурентного элюирования свободным лигандом важным параметром во всех случаях является концентрация иммобилизованного лиганда. Если концентрация последнего чрезмерно велика, то в случае систем с высоким сродством возникают трудности при применении этого метода элюирования (разд. 3).
Элюирование буфером, содержащим свободный лиганд, является идеальным методом, но иногда такой путь может оказаться дорогостоящим. Часто экспериментаторы используют элюенты с довольно высокими концентрациями лиганда; это обусловлено тем, что в конкретных условиях применения данного буфера взаимодействие вещества с колонкой настолько сильно, что необходима высокая концентрация элюирующего лиганда. Если для ослабления взаимодействия вещества с адсорбентом вначале изменяют элюирующий буфер, то затем можно использовать для элюирования более низкую концентрацию свободного лиганда. Тщательный подбор концентраций иммобилизованного лиганда и элюирующего лиганда приводит к улучшению результатов десорбции и более экономичному рас-
8—139
114
Глава 4
ходу лиганда. Концентрацию элюирующего лиганда можно легко установить путем пропускания растворов с линейным градиентом свободного лиганда и определения концентрации лиганда, соответствующей максимуму пика десорбции данной макромолекулы.
При проведении аффинного элюирования необходимо учитывать некоторые аспекты взаимодействия лиганд — макромолекула. Увеличение концентрации соли может значительно уменьшить биоспецифическое взаимодействие, но может также ослабить последующее взаимодействие со свободным лигандом при аффинном элюировании. Увеличение концентрации соли уменьшает неспецифические ионные взаимодействия, но может также усиливать гидрофобные взаимодействия, особенно при наличии на сорбенте полиметиленовых вставок. Если важную роль при связывании играют гидрофобные взаимодействия, то более эффективным может быть уменьшение концентрации соли. Кроме того, можно использовать изменение pH или введение агентов, уменьшающих поверхностное натяжение (для ослабления гидрофобных и вандерваальсовых взаимодействий). В качестве последних могут применяться неионный детергент, такой, как тритон X-IOO до 1%-ной (об./об.) концентрации в буфере, этиленгликоль [10—50% (об./об.)] или относительно небольшие количества этанола [до 5% (об./об.)]. Маловероятно, чтобы эти вещества могли вызывать изменения константы ассоциации с заряженными лигандами. После предварительного уравновешивания колонки указанным буфером в него вводят лиганд для аффинного элюирования. Очевидно, могут быть использованы также аллостерические модифицирующие агенты или ингибиторы взаимодействия лиганд — макромолекула, причем приведенное выше обсуждение по применению свободного лиганда полностью относится и к указанным агентам.
8.2. Элюирование коферментами
В работе [18] исследовалась способность ряда биоспецифических элюентов десорбировать глюкоза-6-фосфат- и глутамат-дегидрогеназы, связанные с иммобилизованными триазиновы-ми красителями. Ниже приводятся данные для первого фермента.
В табл. 2 приведены результаты элюирования глюкоза-6-фос-фатдегидрогеназы из L. mesenteroides, связанной с гелем мат-рекс оранжевый В. В случае эффективного биоспецифического элюирования фермент вымывался в виде резкого пика. Когда же биоспецифическое элюирование оказывалось неэффективным, количественное элюирование достигалось пульсирующим введением 50 мкМ NADP+ В табл. 3 приведены данные по очистке с использованием эффективных биоспецифических элюен-
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed