Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Субстрат. Перемешивают казеин (20 г) (Е. Merck, ФРГ) с водой (350 мл) и 0,5 M NaOH (32 мл) при 600C до растворения казеина, после чего раствор охлаждают до комнатной температуры и доводят pH до 8,0 путем добавления 0,1 M HCl. Добавляют воду до конечного объема 500 мл (легкое помутнение может быть вызвано агрегацией казеина).
Методика. Субстрат (20 мл) и трипсин — эуперит С (2 г) перемешивают при 37 °С (pH 8,0) в ячейке pH-метра с автоматическим поддержанием pH и записью показаний для определения
Лиганды для иммобилизации
137
степени гидролиза. Через 10 мин инкубации отделяют шарики на пористом стеклянном фильтре (пористость 2) и инкубируют еще дважды по 10 мин, как описано выше. Повторяют процесс инкубации и фильтрования еще два раза.
Активность рассчитывают как среднее значение активностей после второго и третьего циклов инкубации. 1 E=I мкмоль субстрата, гидролизуемого за 1 мин.
Казеинолитическая активность трипсина, иммобилизованного на эупергите С по описанной выше методике, составляет 10 Е/г влажных шариков.
2.2.3. Иммобилизация пепсина на эупергите С.
1) Пепсин (150 мг) растворяют в 1,0 M калийфосфатном буфере (pH 5,5; 4 мл; получен смешиванием 91 мл 1,0 M KH2PO4 и 9 мл 1,0 M K2HPO4).
2) Добавляют к 1 г эупергита С.
3) Некоторое время перемешивают, а затем оставляют без перемешивания на 72 ч при комнатной температуре.
4) Промывают, как описано выше в разд. 2.2.
5) Хранят в 0,1 M калийфосфатном буфере (pH 5,0), содержащем этиловый эфир л-гидроксибензойной кислоты (0,05% масс/об.).
Активность, определенная с использованием гемоглобина в качестве субстрата, составляет 2500—3000 Е/г влажного сорбента.
2.2.4. Иммобилизация липазы (из поджелудочной железы) на эупергите С.
1) Липазу (200 мг) растворяют в 1,0 M калийфосфатном буфере (pH 7,5; 4 мл).
2) Полученный раствор добавляют к эупергиту С (1 г), суспензию тщательно перемешивают и оставляют без перемешивания при комнатной температуре.
3) Промывают, как описано выше.
Согласно опубликованным данным, средняя активность иммобилизованной по этой методике липазы составляла 18 Е/г влажных шариков.
2.2.5. Иммобилизация рибонуклеази на эупергите С.
1) Рибонуклеазу (50 мг) растворяют в 1,0 M калийфосфатном буфере (pH 7,5; 2 мл), содержащем этиловый эфир л-гидроксибензойной кислоты (0,05% масс/об.).
2) Этот раствор добавляют к эупергиту С (250 мг), хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре (23°С) на 72 ч.
3) Промывают, как описано выше.
4) Хранят при 5 °С в 0,1 M калийфосфатном буфере (рН7,5). Определяют активность РНКаза-эупергита с помощью pH-
138
Глава 5
метра с автоматической бюреткой и записью показаний, как описано выше для трипин-эупергита С.
Субстрат. РНК (Ю г) из дрожжей (Boehringer Mannheim GmbH, ФРГ) растворяют в 0,2 M NaOH (125 мл). С помощью 0,1 M NaOH (или 0,1 M HCl) доводят pH до 7,5 и разбавляют дистиллированной водой до конечного объема 250 мл.
Субстрат (20 мл) инкубируют с РНКаза-эупергитом С (500 мг влажных шариков) при 37 °С (pH 7,5). Титруют 0,5 M NaOH. Используя те же шарики, осуществляют три последовательные инкубации. Ферментативную активность определяют по тангенсу угла наклона начального участка зависимости скорости реакции от времени (т. е. количество раствора NaOH, пошедшего на титрование в первые 5 мин); рассматривают среднее значение активности из значений, найденных для второго и третьего циклов инкубации. 1 E=I мкмоль гидролизованной фосфо-эфирной связи в минуту.
Активность РНКаза-эупергита С, полученного вышеуказанным методом, составляет —60 Е/г влажного сорбента.
2.2.6. Иммобилизация гемоглобина на эупергите С.
1) Человеческий гемоглобин (Sigma, тип IV) (125 мг) растворяют в 1,0 M калийфосфатном буфере (pH 7,5, содержит 0,1% азида натрия) (5 мл). Добавляют этот раствор к эуперги-ту С (Ir); хорошо перемешивают и оставляют без перемешивания на 72 ч при комнатной температуре.
2) Промывают три раза 1,0 M NaCl и пять раз дистиллированной водой.
3) Смешивают промытые шарики с меркаптоэтанолом [5%-ный (об./об.) раствор, 2,5 мл], доводят pH до 8,0 и оставляют на ночь при комнатной температуре.
4) Промывают дистиллированной водой (10 раз).
5) Шарики упаковывают в небольшую колонку и промывают 0,1 M калийфосфатным буфером (pH 7,5; 50 мл), 0,5 M калий-фосфатным буфером (pH 7,5; 50 мл), 3,5 M тиоцианатом натрия (50 мл) и в заключение буфером состава 0,01 M фосфат натрия, (pH 7,2)+0,15 M NaCl; промывные воды контролируют по поглощению при 418 нм. Промывание заканчивают, когда поглощение составляет <0,01.
2.2.7. Аффинная очистка антител к человеческому гемоглобину из сыворотки крови козы с использованием иммобилизованного на эупергите С гемоглобина.
1) Антисыворотку (антитела козы против человеческого гемоглобина) (1 мл) осторожно наносят на колонку с шариками, полученными, как описано выше, в разд. 2.2.6.
2) Добавляют 1 мл 0,01 M натрийфосфатного буфера (pH 7,2), содержащего 0,15 M NaCl.
Лиганды для иммобилизации
139
3) Встряхивают колонку (или перемешивают путем вращения закрытой колонки) в течение 1 ч.