Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 56

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 106 >> Следующая

Аминокислоты Триптофан
5-Гидрокситриптофан Кинуренин
З-Гидроксикинуренин
Производные кумарина
Варфарин
Фенпрокумон
Сульфоксиды
Соединения, общая формула которых изображена на рис. 7:
а) R=H, R3-R8=CH3, R4=CH3O: R1 = CH3, R2=H; R1=MeO, R2=H; R1 = R2=H; R1 = Cl1 R2=H; R1=Br, R2-H; R1 = (CHs)2CH, R2=H; R1 = = (СН3)зС, R2=H; R1 = CH3, R2= = CH3OCO
б) R=H, R3=R5=H1 R4=CH3: R1 = = СН3, R2=CH3OCO; 2-метилсуль-финилбензойная кислота
Производные аминокислот
N-Формилтриптофан
N - Ацетил тр иптоф ан
Этиловый эфир N-ацетилтриптофана
N-Бензоилсерин
N- (4-Нитробензоил)серин
^(2,4-Динитрофенил)серин
N-Бензоилаланин
N- (4-Нитробензоил) аланин
N- (2,4-Динитрофенил) аланин
N- (2-Нафтоил) аланин
^(2-Теноил)аланин
N-Бензоилфенилаланин
N- (2-Нафтоил) фенилаланин
N-Бензоилтреонин
N- (2,4-Динитрофенил) треонин
N-Бензоилметионин
N-Бензоиллейцин
N- (2,4-Динитрофенил) аспарагиновая кислота
N-(2,4-Динитрофенил) глутаминовая кислота
вующей аминокислоты. Результаты оптического расщепления Ы-(2,4-динитрофенил)-пь-серина приведены на рис. 5.
3) Производные триптофана. Было показано, что из числа этих соединений хроматографией на колонках с БСА-силикаге-лем могут быть расщеплены наряду с DL-триптофаном также 5-гидрокси-оь-триптофан, N-формил- и Ы-ацетил-оь-триптофан и этиловый эфир Ы-ацетил-оь-триптофана [17]. Результаты полного оптического расщепления последнего приведены на рис. 6.
4) Ароматические сульфоксиды. Сульфоксиды, имеющие неодинаковые S-заместители, хиральны и поэтому могут быть расщеплены на оптические антиподы (рис. 7 и 8). Было показано, что соединения общего типа I (R = H) расщепляются на колонках с БСА-силикагелем [13, 18].
В табл. 1 приведен перечень соединений, успешно расщепленных к настоящему времени методом ВЭЖХ на БСА-силика-геле.
3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛЕКТИНОВ
3.1. Иммобилизация лектинов проростков пшеницы на сефарозе
1 г (сухого вещества) CNBr-активированной сефарозы (методика активирования описана в гл. 3) инкубируют при 4 °С с осторожным перемешиванием в течение 24 ч с 25 мг агглютини-
150
Глава 5
на проростков пшеницы (АПП) в ОД M NaHCO3, содержащем 0,5 M NaCl и хитиновые олигосахариды в концентрации 10— 50 ммоль/л (содержание последних определено по восстанавливающим эквивалентам с использованием глюкозы в качестве стандарта). Оценить количество связывающегося лектина можно по разности, найдя содержание несвязавшегося с сефарозой белка (измерение поглощения при —280 нм). С носителем должно связаться —90—95% агглютинина проростков пшеницы. Хранят АПП-сефарозу при 4 0C в натрийфосфатном-№С1-буфере„ содержащем азид натрия (0,5% масс/об.) и N-ацетил-о-глюко-замин (0,1 моль/л).
3.1.1. Конденсация с агарозой.
1) CNBr-активированные агарозные шарики промывают на воронке Бюхнера 5—6 объемами ледяной дистиллированной воды и затем 0,5 M NaHCO3 (pH 8,5).
2) Добавляют раствор лектина в 0,5 M NaHCO3.
3) Осторожно перемешивают или лучше встряхивают суспензию в течение ночи при комнатной температуре. В результате получают гель, содержащий 1—5 мг лектина/г влажного геля.
4) Непрореагировавшие активные группы блокируют путем подобной же обработки насыщенным раствором глицина в течение 24 ч. Ионогенная карбоксильная группа глицина экранируется благодаря наличию основной иминогруппы в имидокар-бонате.
5) Полученный адсорбент с иммобилизованным лектином тщательно промывают и уравновешивают 20—50 мМ фосфатным буфером (pH 7,2), содержащим 0,15 моль/л NaCl.
6) Наносят хроматографируемый образец и промывают колонку уравновешивающим буфером, пока поглощение в элюате при 280 нм не вернется к фоновому значению.
7) Связавшийся материал элюируют в колонке тем же буфером, содержащим 0,1^-0,3 M соответствующего сахара.
3.1.2. Иммобилизация растительных лектинов на агарозе. После активации 40 мл агарозы бромоцианом CNBr (6 г) добавляют к гелю 60 мл ледяного 0,1 M фосфата натрия (pH 7,4), содержащего конканавалин А (500 мг) и а-метил-о-маннопиранозид (0,1 М). Через 16 ч при 4 °С добавляют глицин (2 г) и продолжают инкубацию в течение 8 ч при комнатной температуре. Полученный адсорбент содержит 5,5 мг белка/мл геля. Аналогично присоединяют к активированной агарозе агглютинин проростков пшеницы (1,4 мг/мл) в присутствии 0,1 M N-ацетил-о-глюкозамина; на 1 мл геля присоединяется 1,1 мг белка.
Лиганды для иммобилизации
151
3.2. Иммобилизация гепарина
5.2.7. Иммобилизация гепарина на эупергите С.
1) Готовят раствор гепарина (Sigma, марки 1, из слизистой оболочки кишечника свиньи) (100 мг) в воде (6 мл) и доводят до pH 10-ьП путем добавления 1,0 M NaOH.
2) Общий объем доводят до 8 мл и добавляют этот раствор к эупергиту С (2,0 г).
3) Смесь выдерживают без дальнейшего перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре, затем промывают водой до нейтрального pH.
4) При необходимости удаляют оставшиеся оксирановые группы обработкой меркаптоэтанолом (см. гл. 1).
3.2.2. Гепарин-ультрогель. Гепарин-ультрогель A4R сочетает в себе свойства обычного растворимого гепарина со свойствами ультрогеля A4 (шарики 4%-ной агарозы) и поставляется фирмой Reactifs IBF. В работе используют гепарин, полученный из слизистой оболочки кишечника свиньи и очищенный с сохранением полной биологической активности. Он имеет молекулярную массу —10000 и активность >150 USP Е/мг. Предел исключения матрицы ультрогеля A4 составляет несколько миллионов, что дает возможность использовать гепарин-ультрогель A4R для очистки соединений с очень большой молекулярной массой, таких, как липопротеины сыворотки.
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed