Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 8. Очистка GGT (легкая форма) из 180 г гепатомы Морриса
5123 D
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная активность , E Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %
Гомогенат 800 17 200 640 0,04 1 100
Суспензия остатка 150 3820 384 0,1 2,5 60
после центрифуги-
рования при
100 000 g
После солюбилизации 130 1 315 290 0,2 5 46
бромелаином
Элюат с иммуноад- 4 0,2 150 740 LlS 500 23
сорбента3
а Иммобилизованные антитела против GGT из почек крысы (колонка 1,5 мл). Элюирование GGT водой.
11-139
162
Глава 5
4.7. Заключительные замечания
При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффин-ной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсор-бенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологи-чески неразличимы.
5. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ГЕПАРИН-СЕФАРОЗЕ И КАЗЕИН-СЕФАРОЗЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ И РАЗДЕЛЕНИЯ ДНК-ЗАВИСИМЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗ И ПРОТЕИНКИНАЗ
Л Мушинска, Э. Бер, Г. Добровольска (G. Muszynska, Е. Бег, G. Dobrowolska)
5Л. Введение
Несмотря на то что гепарин — общий лиганд для аффинной хроматографии, возможности его применения еще должны быть полностью оценены. Гепарин — кислотный мукополисахарид, который взаимодействует с основными группами на поверхности многих белков, и его линейная структура может имитировать структуру нуклеиновых кислот. Способность гепарина ингибиро-вать ферменты, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот, была использована для очистки на гепарин-агарозе ДНК-и РНК-полимераз [35—42], рестриктирующих эндонуклеаз [43] и факторов белкового синтеза [44]. Недавно было показано [45], что гепарин-агароза может быть использована для одновременного разделения и очистки различных типов протеинкиназ и различных классов ДНК-зависимых РНК-полимераз. При этом РНК-полимераза I элюировалась вместе с казеинкиназой. Для разделения этих ферментов был использован казеин, ковалентно связанный с сефарозой. Казеинкиназы представляют собой ки-назы, фосфорилирующие серильные и треонильные остатки в
Лиганды для иммобилизации
163
кислотных областях поверхности белков. Поскольку казеин не является природным субстратом рассматриваемых здесь ферментов, биологическая роль этих киназ остается неясной. Имеются предположения, что некоторые из них могут принимать участие в фосфорилировании РНК-полимераз [35], влияя на регуляцию синтеза нуклеиновых кислот.
Ниже описаны методы с использованием иммобилизованных гепарина и казеина для очистки и разделения двух классов РНК-полимераз и различных типов протеинкиназ.
5.2. Основные экспериментальные методики
5.2Л. Получение экстрактов ферментов. Зерна кукурузы замачивают на 12 ч и проращивают в течение 48 ч в темноте при 26 °С; отделяют проростки семян. Собранный материал можно хранить в жидком азоте.
Для выделения ферментов используют следующую методику.
1) Замороженные проростки (20 г) и стеклянные шарики (3—4 г) помещают в ступку и тщательно растирают пестиком при добавлении небольшого количества жидкого азота.
2) После испарения жидкого азота к полученному порошку медленно добавляют 40 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 7,9), 6 мМ MgCl2, 0,05%-ный (масс/об.) монотиогли-церин, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ фенилметилсульфонил-фторид (для ингибирования протеазной активности) и 250 мМ сульфат аммония. Смесь перемешивают.
3) Гомогенат центрифугируют при 10 000 об/мин в течение 10 мин.
4) Супернатант помещают в ледяную баню, а твердый остаток суспендируют в 20 мл буфера и воздействуют на суспензию ультразвуком (3 раза по 40 с).
5) Суспензию центрифугируют, как описано выше, и объединяют супернатанты от обоих центрифугирований.
6) Из полученного раствора белки осаждают путем медленного добавления твердого сульфата аммония до концентрации 2,2 моль/л при постоянном перемешивании раствора на магнитной мешалке.
7) Через 1 ч осадок отделяют с помощью центрифугирования при 5000 об/мин в течение 45 мин.
8) Твердый остаток смешивают с сульфатом аммония, используя гомогенизатор Поттера и буфер А (табл. 9); проводят центрифугирование при 10 000 об/мин в течение 15 мин и отделяют супернатант; этот материал служит в качестве исходного при получении чистого фермента.
164
Глава 5
5.2.2, Определение ферментативной активности и содержания белка.
Определение активности протеинкиназы. Доводят конечный объем до ОД мл; 25 мМ трис-HCl (pH 7,9), 20 мМ MgCl2, 0,5 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мг/мл казеина, 20 мкМ [32P]ATP [100— 200 имп/(мин-пкмоль)]. Добавляют 40 мкл препарата протеинкиназы. Инкубируют в течение 20 мин при 37 °С; для прекращения реакции из смеси отбирают аликвоту 75 мкл и наносят на кружок из фильтровальной бумаги Whatman 3MM (диаметр
