Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Было обнаружено, что для присоединения АФБК к другим носителям, например триазинактивированной бумаге, эпоксиак-тивированной сефарозе 6В (Pharmacia) и эупергиту С (Rohm Pharma), удовлетворительные результаты дает 0,5 M калийфос-фатный буфер (pH 7,8), содержащий 0,1 моль/л АФБК. Оставшиеся активные группы могут быть блокированы этаноламином (1,0 M).
Лиганды для иммобилизации
173
6.1. Хроматография с использованием иммобилизованной АФБК
1) Нуклеозиды. Используют колонки объемом 1,5 мл (3,9Х XOJ см) или 2 мл (5,2x0,7 см), скорость потока 2 мл/ч, собирают фракции по 1 или 2 мл. Предварительно колонку уравновешивают буфером (50 мМ фосфат калия, содержащий 1,0 моль/л NaCl, pH 7,8) в течение -24 ч. На колонку наносят смесь нуклеозидов и дезоксинуклеозидов (по 2,5 мкмоль) в уравновешивающем буфере (общий объем раствора 0,4 мл). После того как раствор образца войдет в гель (чуть ниже поверхности геля), остатки этого раствора смывают, добавляя в колонку дополнительно небольшой объем буфера (0,4 мл). Колонку промывают уравновешивающим буфером. Дезоксинуклеозиды собирают в исключающемся объеме, а прочно удерживаемые (сильно связанные) нуклеозиды десорбируют тем же буфером, содержащим 100 ммоль/л сорбита. Работу на колонках проводят при 4 °С или при комнатной температуре. Кривые элюирования записываются на основании данных по поглощению при 260 нм.
2) Г л ико проте ины. На колонку (объем 2 мл) с АФБК-мат-рекс-гелем наносят белок (2—4 мг), растворенный в —250 мкл буфера (50 мМ таурин/NaOH, pH 8,7, содержащий 20 ммоль/л MgCl2); может возникнуть необходимость использования градиента концентрации MgCl2 в интервале 0ч-50 ммоль/л. При скорости потока 2 мл/ч собирают фракции по 2 мл. Элюирование связавшегося белка достигается уравновешивающим буфером, содержащим 50 ммоль/л сорбита или 50 ммоль/л трис-НС1.
Колонки можно регенерировать путем промывания 50 мМ NaOH или 200 мМ натрийацетатным буфером (pH 5,4).
7. ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КРАСИТЕЛЕЙ
7.1. Получение матриц с иммобилизованными красителями
7.1.1. Метод Хейнса и де Мура [53].
1) Агарозные шарики (5 г влажного носителя) переносят на воронку с пористым стеклянным фильтром и промывают (с отсасыванием) дистиллированной водой для удаления азидного консерванта.
2) Осторожно продолжают отсасывание до появления трещин на поверхности геля.
3) К полученной агарозе добавляют раствор соответствующего красителя (80 мг в 2,5 мл дистиллированной воды) и перемешивают на смесителе Коултера.
4) После добавления раствора Na2CO3 (168 мг в 2,5 мл дистиллированной воды) и тщательного перемешивания суспензию инкубируют в течение 40 ч при 45 °С с периодическим перемешиванием.
174
Глава 5
5) Выливают окрашенный гель на воронку с пористым стеклянным фильтром и промывают дистиллированной водой до отсутствия свободного красителя в элюате.
6) Гель промывают 1,0 M KCl и 4,0 M мочевиной для удаления оставшегося красителя и затем тщательно промывают дистиллированной водой.
7.1.2. Метод Дина и Уотсона [54]. Некоторые матрицы с иммобилизованным красителем могут быть получены более эффективно по методике €с включением соли», согласно которой для ускорения реакции и уменьшения гидролиза триазинового компонента в инкубационную смесь добавляют хлорид натрия [58].
1) К агарозным шарикам (10 г влажного носителя) в дистиллированной воде (25 мл) добавляют раствор красителя (250 мг в 25 мл дистиллированной воды), смесь перемешивают на смесителе Коултера в течение 5 мин.
2) Добавляют 20%-ный (масс/об.) раствор NaCl и перемешивают еще 30 мин.
3) Затем добавляют 1,0 M Na2COs (12,5 мл), смесь тщательно перемешивают и инкубируют в течение 40 ч при 45 °С с осторожным перемешиванием.
4) После присоединения отмывают окрашенный гель от не-связавшегося красителя, как описано выше.
Матрицы с иммобилизованными красителями с различными концентрациями лиганда могут быть получены путем изменения количества красителя, добавляемого к гелю в реакции присоединения.
7.1.3. Хранение и регенерация матриц с иммобилизованными красителями. Матрицы с красителями, не находящиеся в работе, следует хранить во влажном виде при 4 °С в 0,1%-ном (масс/об.) растворе азида натрия. После использования матрицы с красителями можно регенерировать путем промывания 4,0 M мочевиной в 0,5 M NaOH (три объема колонки) для удаления связавшегося материала с последующим уравновешиванием колонки соответствующим буфером (15—20 объемов колонки).
7.1.4. Выбор аффинного сорбента с иммобилизованным красителем. Эксперимент проводится при 4 °С.
1) Матрицы с иммобилизованными красителями упаковывают в поликарбонатные колонки (2,3X0,7 см).
2) Колонки промывают уравновешивающим буфером (10— 15 объемов колонки) и затем на каждую наносят образец, предварительно диализованный против уравновешивающего буфера.
3) Промывают колонки уравновешивающим буфером до выхода с колонок по 5 мл элюата.
Лиганды для иммобилизации
175
а) При исследовании возможности биоспецифического элюирования готовят раствор соответствующего элюирующего вещества в уравновешивающем буфере (1 мл), доводят pH до требуемого значения и наносят этот раствор на колонку. Колонку промывают уравновешивающим буфером до выхода 5 мл элюата.
