Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 9. Буферы, используемые для аффинной хроматографии
Буфер
Состав
Для гепарин-сефарозы
Буфер А
Буфер Б Буфер В Буфер Г
Для казеин-сефарозы
50 мМ трис-HCl (pH 7,9)+6 мМ MgCl2H-OJ мМ фенилметил-сульфонилфторид+10 мМ меркаптоэтанол+0,05%-ный (об./об.) монотиоглицерин+20%-ный (об./об.) глицерин Буфер А+75 мМ (NHi)2SO4 Буфер А+300 мМ (NH4)2S04 Буфер А+600 мМ (NH4bS04
Буфер Д
Буфер E Буфер Ж Буфер 3
10 мМ трис-HCl (pH 7,5) + 10 мМ MgCl2+22 мМ NH4Cl+
+ 10 мМ меркаптоэтанол+5%-ный глицерин Буфер Д+Ю0 мМ NaCl Буфер Д+200 мМ NaCl Буфер Д+600 мМ NaCI
2,5 см); фильтр немедленно промывают 5 раз 5%-ной (масс./об.) трихлороуксусной кислотой (по 50 мл на фильтр), а затем 5 мл 96%-ного (об./об.) этанола. Фильтры сушат и определяют радиоактивность на сцинтилляционном счетчике с толуолом в качестве растворителя.
Определение активности PH К-полимеразы. Доводят конечный объем до 0,1 мл; 100 мМ трис-HCl (pH 8,0), 1 мкМ дитио-треитол, 10 мМ MgCb, 1 мМ МпСЬ, 25 мкг денатурированной нагреванием ДНК из тимуса теленка, по 50 нмоль GTP, CTP и ATP и [3H]UTP (130 пмколь, соответствующие 5 мкКи). Вводят в реакцию препарат РНК-полимеразы. После инкубации в течение 20 мин при 300C реакцию прекращают; отбирают аликвоты по 75 мкл и наносят на кружки из фильтровальной бумаги Whatman DE-81. Фильтры промывают 5 раз 5%-ной (масс/об.) холодной трихлороуксусной кислотой, содержащей 1% (масс./об.) пирофосфата натрия, и 1 раз смесью этанол — эфир (1 : 1); фильтры сушат и определяют радиоактивность на сцинтилляционном счетчике с толуолом в качестве растворителя.
Лиганды для иммобилизации
165
Определение концентрации белка проводят по методике Брад-форда с кумасси голубым [46]; градуировочный график строят по бычьему сывороточному альбумину,
5.3. Оборудование и биоспецифические адсорбенты для аффинной хроматографии
1) Для проведения эксперимента необходимы две хромато-графические колонки (1,6X20 см и 0,9x30 см), которые поставляются фирмой Pharmacia Fine Chemicals (марки К16/20 и К9/30), перистальтический насос (для подачи растворов на колонку) и коллектор фракций.
2) CNBr-активированная сефароза 4В выпускается фирмой Pharmacia Fine Chemicals; можно также провести активацию сефарозы по методике, предложенной в работе [47]; см. также в гл. 1, разд. 1.
3) Можно использовать гепарин-сефарозу, выпускаемую фирмой Pharmacia Fine Chemicals или же синтезированную путем присоединения гепарина к CNBr-активированной сефарозе 4В, как описано в работе [48].
4) Казеин-сефарозу 4В можно получить присоединением казеина к CNBr-активированной сефарозе 4В.
Методика [49]. Готовят суспензию казеина (500 мг) в 0,1 M NaHCO3 (250 мл), содержащем 0,5 M NaCl. Поскольку казеин не растворяется в этом буфере, доводят pH до 13 путем добавления NaOH, а затем вновь до 8,0 путем добавления HCl. Добавляют полученный раствор казеина к CNBr-активированной сефарозе 4В (50 мг) и осторожно перемешивают в течение 18— 20 ч при 40C Суспензию промывают 0,1 M NaHCO3, содержащим 0,5 M NaCl, и суспендируют в 1,0 M этаноламине (pH 8,0) при 2-часовом перемешивании. Дважды промывают 0,1 M ацетатным буфером (pH 4,0), содержащим 1,0 M NaCl, и в заключение 0,1 M боратным буфером (pH 8,0), содержащим 1,0 M NaCI. Перед упаковкой уравновешивают казеин-сефарозу буфером Д (табл. 9).
5.4. Методика хроматографии на гепарин-сефарозе
5.4.1. Колоночный метод.
1) В колонку (1,6x20 см) заливают при 4 °С суспензию 14 г влажной гепарин-сефарозы в буфере Б ( — 14 мл).
2) Дают гелю осесть на 3—4 см.
3) После выхода с колонки 12—13 мл буфера гель уравновешивают буфером Б (150 мл) при скорости потока 16— 20 мл/ч, используя перистальтический насос.
4) Быстро доводят электропроводность раствора ферментов
166
Глава 5
до уровня буфера Б разбавлением буфером А до конечного объема 100—110 мл.
5) С помощью насоса вводят раствор ферментов на колонку и промывают колонку 250 мл буфера Б (лучше в течение ночи).
6) Затем промывают буфером В, собирая фракции между 15 и 25 мл, содержащие белковый пик.
7) Промывают колонку буфером В ( — 50 мл), пока содержание белка в элюате не станет <0,1 мг/мл. Промывают буфером Г и собирают белковый пик, который должен выходить между 13 и 28 мл.
Таблица 10. Данные по очистке РНК-полимеразы и протеинкиназыа
Стадия очистки Гнстонкиназа Казеннкиназа РНК-полн-мераза Содержание белка, мг
Удельная активность, Е/мг Выход, % Удельная активность, Е/мг Выход, % Удельная активность, Е/мг Выход. %
Исходный го- 50 —б 75 _б 1,5 — б 436
могенат
Осадок после 88 100 135 100 5 100 326
обработки
сульфатом
аммония
Гепарин-агаро-
за
Несвязав- 102 77 51 18 0,7 9 216
шаяся
фракция 15 21
Элюирова- 65 15 1662 87 23
ние 300 мМ
(NH4)2S04 Элюирова- 251
ПО 2 393 3 61 4
ние 600 мМ
(NH4)2S04
Казеин-агаро-
зав:
Несвязав- Не опре- Не опре- НО 4 21 17 16
шаяся деля- деля-
фракция лась лся
Элюирова- » 38 100 57 0 0 0,7
ние 600 мМ
NaCl
