Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
4.5.2. Иммуноаффинная хроматография.
1) Колонку упаковывают суспензией иммуноадсорбента и промывают несколькими объемами NaCl-натрийфосфатного буфера. Используют колонки с упакованными иммуноадсорбента-ми объемом 5 мл (1,2x4,5 см) или 1,5 мл (0,8x3 см).
2) К препарату солюбилизированной GGT добавляют хлорид, натрия (85 мг/10 мл), пропускают раствор через колонку с им-муноадсорбентом при комнатной температуре и собирают фракции (по 5 мл или 1 мл при скорости потока 40 или 10 мл/ч соответственно).
3) Наносят —1000 ед. GGT почек крысы на 1 мл иммобилизованных антител против GGT почек крысы и 400 ед. GGT почек быка на 1 мл иммобилизованных антител против GGT почек быка. Фракции, содержащие GGT, не связавшуюся с иммуноад-сорбентом, можно хроматографировать повторно.
4) Промывают колонку NaCl-натрийфосфатным буфером. (10 объемов) и элюируют GGT либо 0,1 M этаноламином (скорость потока 10 и 3 мл/ч), либо деионизованной водой (скорость потока ~2 и 0,5 мл/ч).
5) Фракции, элюированные этаноламином, следует нейтрализовать 0,5 M уксусной кислотой по фенолфталеину [добавляют 1 каплю 0,1%-ного (масс/об.) спиртового раствора индикатора]; для определения GGT-активности отбирают пробы небольшого объема (1-М0 мкл).
6) Объединяют фракции с активностью, превышающей 2 ед./мл; полученный раствор вновь хроматографируют для повторной очистки или концентрируют путем ультрафильтрации.
4.5.3. Повторная хроматография однократно очищенного препарата GGT. К препарату GGT, элюированному с иммуноадсорбентов, добавляют хлорид натрия (85 мг/10 мл) и вновь хроматографируют материал в условиях, описанных в разд. 4.5.2. Благодаря этой операции увеличивается удельная активность очищенной GGT, как показано для GGT почек быка и GGT почек мыши (табл. 2 и 7).
4.5.4. Регенерация иммуноадсорбентов. Колонки с иммуноадсор-бентами после элюирования GGT могут быть регенерированы путем промывания 0,2 M глицин-НС1-буфером (pH 2,2; 10 объ-
Лиганды для иммобилизации
157
Таблица 2. Очистка GGT (легкая форма) из 400 г почек быка
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная активность, E Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %-
Гомогенат 1300 31200 10920 0,35 1 100
Суспензия остатка 360 7380 10260 1,4 4 94
после центрифу-
гирования при
100 000 g
После солюбили- 275 1790 7840 4,4 12,6 72
зации с броме-
лаином
Элюат с иммуно- 33 6,9 5915 850 2430 54'
адсорбентаа
Элюат после по- 24 4,0 5030 1230 3515 46.
вторной хрома-
тографии3
а Иммобилизованные антитела против GGT из почек быка (три колонки по 5 мл); Элюирование GGT 0,1 M этаноламином.
емов), а затем NaCl-натрийфосфатным буфером. Регенерированные подобным образом иммуноадсорбенты можно использовать несколько раз без заметной потери связывающих свойств.
4.6. Примеры
4.6.L GGT из почек быка. Легкая форма GGT из почек быка может быть очищена по общей методике, описанной в разд. 4.5. Более высокая удельная активность достигается после повторной хроматографии фермента, элюированного с колонки с им-муноадсорбентом (иммобилизованные антитела против GGT почек быка). Продукт показывает 2500-*-3500-кратное увеличение GGT-активности по сравнению с гомогенатом. Выход очищенного фермента достигает 46%. Данные по очистке суммированы в табл. 2, а кривая элюирования с колонки с иммуноадсорбентом приведена на рис. 9.
Для очистки тяжелой формы GGT из почек быка используется следующая методика.
1) GGT солюбилизируют с помощью 0,5%-ного (об./об.) тритона Х-100, выдерживая смесь в течение 3 ч при комнатной, температуре; нерастворившийся остаток отделяют путем центрифугирования (100 000 в течение 60 мин.
2) Жидкую фазу отделяют и очищают на одной колонке с иммуноадсорбентом (иммобилизованные антитела против легкой формы GGT из почек быка).
158
Глава 5
300
? 200
о о
X
CQ
S 100
ас «о
і
I-
u> 0
Рис. 9. Кривая элюирования GGT (легкая форма) из почек быка с иммуно-адсорбента — иммобилизованных антител против GGT из почек быка. 140 мл супернатанта (4000E) после ферментативного гидролиза твердого остатка (после центрифугирования при 100 000 g") бромелаином пропускали через колонку с иммуноадсорбеитом (1,2X4,5 см), собирая фракции по 5 мл (скорость потока 50 мл/ч). Колонку промывали NaCl-натрийфосфатным буфером и затем 0,1 M этаноламином (10 мл/ч).
3) Колонку промывают NaCl-натрийфосфатным буфером, а затем 0,1 M этаноламином в 0,05%-ном (об./об.) тритоне Х-100.
В результате очистки достигается 860-кратное увеличение активности препарата GGT. Суммарный выход очищенного препарата составляет 44,5%. Данные по очистке суммированы в табл. 3.
4.6.2. GGT из печени быка. Легкая форма фермента из печени быка может быть очищена по общей методике, описанной выше.
Таблица 3, Очистка GGT (тяжелая форма) из 80 г почек быка
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная активность, E Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %
Гомогенат 260 6240 2180 0,35 1 100
Суспензия остат- 72 1480 2050 1,4 4 94
