Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
ка после центри-
фугирования при
100 000 g
После солюбили- 60 710 1350 1,9 5,4 62
зации тритоном
Х-100
Элюат с иммуно- 16 3,2 970 300 860 44,5
адсорбентаа
OJM
этаиоламин
20 25 30 35 40 45 Номер фракции
а Иммобилизованные антитела против GGT из почек быка (легкая форма) (две колонки по 5 мл). Элюирование GGT ОД M этаноламином в 0,5%-ном тритоне Х-100.
Лиганды для иммобилизации
159
Достигается —23000-кратное увеличение ферментативной активности при общем выходе 32%. Данные по очистке суммированы в табл. 4.
4.6.3. GGT из коровьего молока. Для очистки легкой формы GGT можно использовать иммуноадсорбент (иммобилизованные антитела против GGT из почек быка).
1) pH свежего молока со снятыми сливками доводят до 4,6 путем добавления 1,0 M уксусной кислоты; перемешивают 1 ч при комнатной температуре.
Таблица 4. Очистка GGT (легкая форма) из 400 г печени быка
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная Удельная Степень Выход, %.
активность, E активность, Е/мг очистки
Гомогенат 1400 58650 1953 0,033 1 100
Суспензия остат- 360 19 800 1407 0,071 2,1 72
ка после цент-
рифугирования
при 100 000 g
После солюбилиза- 310 3100 1116 0,36 10,8 57
ции с бромелаи-
HOM
Элюат с иммуно- 32 0,89 625 750 22730 32
адсорбентаа
Иммобилизованные антитела против GGT из почек быка (колонка 5 мл). Элюирование GGT 0,1 M этаноламином.
2) Осажденный казеин удаляют путем центрифугирования (300Og в течение 15 мин); полученную сыворотку вновь центрифугируют (100000g в течение 60 мин).
3) Отделяют твердый остаток и проводят протеолиз броме-лаином.
Солюбилизированная GGT молока может быть далее очищена на иммуноадсорбенте, как подробно описано в разд. 4.5. Фермент, элюированный водой, показывает активность в — 13000 раз большую, чем в молоке со снятыми сливками. Суммарный выход очищенного препарата 15%. Данные по очистке приведены в табл. 5.
4.6.4. GGT из почек крысы. Для очистки легкой формы GGT из почек крысы можно воспользоваться описанной выше методикой для проведения иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных антителах против GGT из почек крысы. Фермент, элюированный водой, обладает в 330 раз большей активностью, чем исходный гомогенат при суммарном выходе 46%. Данные по очистке суммированы в табл. 6.
160
Глава 5
Таблица 5. Очистка GGT (легкая форма) из молока коровы
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная активность» E Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход. %
Молоко со сняты- 1800 46800 4030 0,086 1 100
ми сливками Сыворотка Суспензия остат- 1500 46 9900 270 3000 1980 0,3 7,35 3,5 85,5 74 49
ка после центрифугирования при 100 ООО g После солюбили- 43 194 1815 9,37 109 44
зации бромелаи-
HOM Элюат с иммуно-адсорбентаа 19 0,57 617 1090 12675 15
а Иммобилизованные антитела против GGT из почек быка (две колонки по 5 мл). Элюирование GGT водой.
Таблица 6. Очистка GGT (легкая форма) из 72 г почек крысы
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная активность, E Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход %
Гомогенат Суспензия остатка после центрифугирования при 100 000 g После солюбилизации бромелаином Элюат с иммуноад-сорбента8 а Иммобилизованные Элюирование водой. 250 27 25 24 антитела і 2520 158 66 3,5 тротив GGT 10080 6 650 6 250 4 680 из почек * 4 42 95 1320 [рысы (две I 10,5 23,8 330 колонки по 100 66 62 46 5 мл).
4.6.5. GGT из почек мыши. Чувствительный электрофоретиче-ский метод разделения смеси GGT-антител позволяет продемонстрировать сильное иммуновзаимодействие между GGT из почек мыши и антителами против GGT из почек крысы. Это подтверждает возможность использования иммобилизованных антител против GGT из почек крысы в качестве иммуноадсорбента для очистки GGT из почек мыши. Данные по очистке фермента из почек мыши суммированы в табл. 7. Подробная методика во многом аналогична описанной выше общей методике. После повторной хроматографии активность GGT увеличивается в — 530 раз при суммарном выходе 35%.
Лиганды для иммобилизации
16/
Таблица 7. Очистка GGT (легкая форма) из 17 г почек мыши
Препарат Объем препарата, мл Содержание белка, мг Полная активность, E Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %
Гомогенат 65 2340 2500 12,1 1 100
Суспензия остатка 40 900 2160 2,4 2,2 86
после центрифуги-
рования при
100 000 g
После солюбилизации 34 365 2000 5,8 5,1 80
бромелаином
Элюат с иммуноад- 14 2,9 1360 475 432 54
сорбентаа
Элюат после повтор- 12 1,5 870 500 535 35
ной хроматогра-
фии8
а Иммобилизованные антитела против GGT из почек крысы (две колонки по 5 мл). Элюирование GGT 0,1 M этаноламином.
4.6.6. GGT из гепатомы крысы. Используя описанную выше методику, можно очистить также легкую форму GGT из гепатомы Морриса 5123 D. Клетки гепатомы взяты у крыс Буффало через 24 сут после имплантации небольшого количества гепатомной пульпы в заднюю ногу [33]. Фермент гепатомы может быть элюирован с иммуноадсорбента (иммобилизованные антитела против GGT из почек крысы) водой. Для чистого фермента установлено повышение активности в 18 500 раз по сравнению с исходным гомогенатом при суммарном выходе 23%. Данные по очистке суммированы в табл. 8.
