Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
2.9.2. Основы метода. Удерживание на колонке (а для двух оптических изомеров во многих случаях различное удерживание) можно очень эффективно регулировать при помощи подвижной фазы, представляющей собой буферные системы с pH 4ч-9. Энантиоселективные свойства стационарной фазы при связывании растворенного вещества могут быть обусловлены сочетанием кулоновых и гидрофобных взаимодействий, причем суммарный эффект на антиподы различен по стерическим причинам. Связывание со стационарной фазой и, следовательно, наблюдаемое удерживание на колонке могут сильно зависеть от pH и ионной силы, а также присутствия или отсутствия органического растворителя в подвижной фазе (рис. 1). Применяемые в настоящее время колонки имеют ограниченную емкость и могут использоваться только для аналитических разделений; количество вводимого растворенного вещества обычно составляет ~0,5-ь5 нмоль.
2.9.3. Оборудование. Для разделений оптических изомеров необходимо обычное оборудование, комплектно поставляемое фир-
144
Глава 5
мами для ВЭЖХ. Можно использовать относительно недорогой насос высокого давления однопоршневого типа, но предпочти тельно иметь к нему устройство, ослабляющее пульсаци* Стальная колонка, упакованная БСА-силикагелем, должна быт соединена с системой подачи растворителя, а также снабжена клапаном введения образца с петлей объемом 10 или 20 мкл. Выход колонки может быть соединен с различными типами детекторов (УФ-видимый, флуориметрический или электрохимический). Наиболее универсален УФ-детектор с переменной длиной
буфер
удерживание можег быть вызвано:
кулоновым притяжением гидрофобным вза и модеме твием взаимодействием с переносом заряда
pH
ионная сила
поверхностное натяжение (в присутствии органических содержатся: // // Растворителей) заряженные группы гидрофобные положения хиральные участки
Рис. 1. Факторы, влияющие на удерживание на колонках с БСА-силикагелем.
волны, хотя в некоторых случаях, когда требуется очень высокая чувствительность, следует отдать предпочтение электрохимическому или флуориметрическому детектору. И наконец, система для ВЭЖХ обязательно должна включать одноканальный потенциометрический X—У-самописец; при определении энан-тиомерного состава или оптической чистоты вводимых образцов рекомендуется пользоваться электронным интегратором для определения отношений площадей пиков. Полная схема хрома-тографической системы для ВЭЖХ показана на рис. 2. До сих пор все разделения на оптические изомеры осуществлялись путем изократного элюирования; поэтому нет необходимости введения в систему дополнительных устройств создания градиентного элюирования.
2.9.4. Упаковка колонок. Для упаковки аналитических колонок суспензионным методом [15] вполне удобно использовать насос, работающий на сжатом воздухе и соединенный с резервуаром из нержавеющей стали объемом ~75 мл.
1) Прежде всего тщательно очищают все части незаполненной аналитической колонки (размер 4-4-5x150^200 мм), пред-
Лиганды для иммобилизации_Не-
почтительно использовать метанол или ацетон, а также ультразвуковую обработку.
\ 2) После высушивания колонки ее собирают, но пока не присоединяют устройство для введения образца.
3) Отмеряют объем суспензии БСА-силикагеля, соответствующий ~2 г сухого сорбента (для колонки 4,6x150 мм), и диспергируют сорбент (в градуированном цилиндре) в 50 мМ. фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 1% (об./об.) 1-про-панола (75 мл).
насос для ВЭЖХ
подвижные фазы: буферы с 4<рН<9
стальная колонка (4.6x150 мм)
чес кий, электро-химический детекторы'
Рис. 2. ВЭЖХ-система для разделения оптических изомеров на колонках с
БСА-силикагелем.
4) Оставляют суспензию в цилиндре на 20 мин и сливают сверху жидкую фазу. Добавляют буфер, если первая порция жидкости была заметно мутная (из-за мелких частиц). Промывание и отстаивание со сливом жидкости можно повторить, чтобы при работе колонки ее выход не забивался мелкими частицами.
5) Затем заполняют резервуар суспензией и соединяют era с входным отверстием колонки (колонка должна быть перевернута входным отверстием вниз).
6) Присоединяют подходящую трубку к выходу колонки для сбора растворителя.
7) Используя насос, подготовленный для подачи указанного выше фосфатного буфера, начинают упаковывать колонку при давлении —340 бар, пока —250 мл жидкости не пройдет через колонку.
8) После перевертывания колонки на 180° (входное отверстие вверху) насос останавливают и после уравновешивания давления (в течение 5 мин) резервуар отсоединяют, а колонку закрывают с помощью входного устройства. Колонку можно затем непосредственно установить в хроматографическую систему для уравновешивания подвижной фазой.
10—139
146
Глава 5
Изучение удерживания соединения с испапь зованием подвижной (разы состоящей из50мМ фосфатного буфера (pH 7,0) без добавления органического растворителя
удерживание: слишком сильное
приемлемое
слишком слабое
расщепления не наолюдается (нет пиков при элюировании)
_±_
удерживание уменьшают путем добавления в подвижную фазу 2,5% 1 - пропанола
удерживание:слишком сильное ^приемлемое
