Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 48

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 42 43 44 45 46 47 < 48 > 49 50 51 52 53 54 .. 106 >> Следующая

29. Avrameas S., Ternynck T4 Immunochemistry, 6, 53 (1969).
30. Wood K. R4 Stephen J4 Smith H4 J. Gen. Virol, 2, 313 (1968).
31. Mougdal N. R4 Porter R. R4 Biochim. Biophys. Acta, 71, 185 (1963).
32. Weintraub B. D4 Biochem. Biophys. Res. Commun., 39, 83 (1970).
33. Beaumont J. L4 Delphanque B4 Immunochemistry, 6, 489 (1969).
34. Melchers F4 Messer W4 Eur. J. Biochem., 17, 267 (1970).
35. Wofsky L4 Burr B4 J. Immunol., 103, 380 (1969).
36. Bing D. H4 J. Immunol., 107, 1243 (1971).
37. Morgan M. R. A4 Brown P. J4 Leyland M. J4 Dean P. D. G., FEBS Lett, 37, 239 (1978).
38. Morgan M. R. A4 Dean P. D. G4 in: Theory and Practice in Affinity Techniques, Sundaram P. V., Eckstein F. (eds.), Academic Press, 1978, p. 15.
39. Grenot C4 Cuilleron C4 Biochem. Biophys. Res. Commun., 79, 274 (1977).
40. Morgan M. R. A4 Kerr E. J4 Dean P. D. G4 J. Steroid Biochem., 9, 767 (1978).
41. Morgan M. R. A4 Johnson P. M4 Dean P. D. G., J. Immunol. Methods, 23, 381 (1978).
42. Brown P. /., Leyland M. J4 Keenan Л P4 Dean P. D. G., FEBS Lett., 83, 256 (1977).
43. Iqbal M. J4 Ford P., Johnson M. W4 FEBS Lett., 87, 235 (1978).
44. Morgan M. R. A4 Slater N. A4 Dean P. D. G4 Anal. Biochem., 92, 144 (1978).
45. Haff L. A4 Lasky M4 Manrique A4 J. Biochem. Biophys. Methods, 1, 275 (1979).
46. Sada E4 Katoh S4 Shiozawa M4 Biotechnol. Bioeng., 24, 2279 (1982).
47. Walters R. R4 Anal. Chem., 55, 591 (1983).
48. Snyder L. R4 Kirktand J. Introduction to Modern Liquid Chromatography, published by Wiley, New York, 1979, p. 216.
49. Walters R. R4 Anal. Chem., 55, 1395 (1983).
9-139
Глава 5.
ЛИГАНДЫ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ
1. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
1.1. Связывание ДНК с КМ-целлюлозой
LLL Материалы. Карбоксиметшьцеллюлоза (КМ-целлюлоза) типа СМ-23 № 45030 поставляется фирмой SERVA Feinbioche-mical GmbH (Heidelberg); ДНК из тимуса теленка высокополи-меризованная — фирмой Sigma (США).
1.1.2. Получение адсорбента (стандартная методика).
1) Готовят суспензию КМ-целлюлозы (1 г) в 0,5 M NaOH (50 мл) и перемешивают ее 30 мин.
2) После декантации материал промывают водой до pH 8,0 в элюате.
3) Готовят суспензию производного КМ-целлюлозы в воде (100 мл) и доводят pH до 3,5 путем добавления 0,1 M HCl.
4) Суспензию фильтруют с отсасыванием, промывают материал этанольно-эфирной смесью (1:1) (об./об.) (3 раза по 5 мл), затем эфиром (20 мл) и сушат в течение 60 мин при 40 °С.
5) К полученной КМ-целлюлозе добавляют 20 мг ДНК из тимуса теленка, растворенной в воде (10 мл).
6) Полученную суспензию выливают в чашку Петри и медленно выпаривают воду в течение 60 ч при 40 0C; для регулирования процесса высушивания чашку Петри время от времени накрывают крышкой.
7) Полученную ДНК-целлюлозу собирают с поверхности чашки, измельчают, суспендируют в 0,05 M фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 50% (об./об.) глицерина (50 мл), и оставляют на 24 ч при комнатной температуре.
8) Продукт промывают водой (10 раз по 10 мл) и хранят при 4 °С в 1,0 M растворе NaCl.
При использовании в качестве исходной КМ-целлюлозы фирмы SERVA полученный адсорбент содержит ~15 мг ДНК на 1 г сухой КМ-целлюлозы, что соответствует ~2,5 мг/мл сорбента.
Лиганды для иммобилизации
1.2. Иммобилизация нуклеиновых кислот
на бисоксиранактивированных полисахаридах
1.2.1. Активация матриц. Бисоксирановая активация сефарозы 6В осуществляется по методике, предложенной Поратом и Сандбергом [1].
1) Целлюлозу (10 г) активируют путем суспендирования в 1,0 M NaOH (30 мл), содержащем борогидрид натрия (60мг).
2) Добавляют диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (20 мл) и смесь энергично встряхивают в течение 20 ч при комнатной температуре.
3) После фильтрования отсасыванием целлюлозу тщательно промывают ледяной дистиллированной водой до нейтральной реакции элюата.
4) Лиофилизованный материал хранят в эксикаторе при —20 °С. Активированная по данному методу целлюлозная матрица содержит ~10—15 мкмоль реакционноспособных групп на 1 г.
1.2.2. Иммобилизация полинуклеотида.
1) Требуемое количество полинуклеотида растворяют в 20 мМ KCl (5—10 мл/г сухой матрицы), содержащем 10% (об./об.) 1,4-диоксана, и доводят pH раствора до 12,0 путем добавления триэтиламина.
2) Раствор нуклеотида добавляют к активированной матрице и смесь выливают в чашку Петри; оставляют для медленного испарения в течение ~60 ч при 35 °С в атмосфере с относительной влажностью ~30%.
3) Для инактивации непрореагировавших эпоксигрупп материал вновь суспендируют в небольшом количестве 0,01 M NaOH и оставляют на 5 сут при комнатной температуре. Эту методику нельзя использовать в случае полирибонуклеотидов.
1.2.3. Десорбция непрореагировавшего лиганда. Поскольку нуклеиновые кислоты и поли нуклеотиды с высокой молекулярной массой неспецифически взаимодействуют с полисахаридными матрицами, важно удалить непрореагировавший лиганд путем тщательного промывания материала десорбирующим раствором. Для этого готовят суспензию адсорбента в растворе с низкой ионной силой (предпочтительно в дистиллированной воде), содержащем 20—50% (об./об.) гидрофильного органического растворителя, например глицерина или формамида, и осторожно перемешивают в течение 2 сут. Продукт промывают дистиллированной водой и хранят в любом нейтральном буферном растворе (предпочтительно в цитрате) или в лиофилизованном виде при 0-^ 5 °С.
Предыдущая << 1 .. 42 43 44 45 46 47 < 48 > 49 50 51 52 53 54 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed