Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 2. Исследование ряда биоспецифических элюентов для десорбция глюкоза-6-фосфатдегндрогеназы из L. mesenteroides, связанной о гелем матрекс оранжевый В
Биоспецнфнческнй элюеат Концентрация, м ноль/л Степень элюирования фермента (от нанесенного количества), %
NADP+ I 85
NADP+ 0,1 80
NADP+ 0,05 78
NADP+ O1OI 13
NAD+ I 11
NAD+ IO 74
NADPH 1 83
NADH 1 4
Глюкоза-6-фосфат 1 7
Тетранатрийпирофосфат 10 0
Тетранатрийпирофосфат 0
6-Фосфоглюконат 1 0
2', 5'-ADP 1 95
2', 5'-ADP 0,05 6
3', 5'-ADP 1 0
2'-AMP 1 0
3'-AMP 1 0
5'-AMP 1 0
5'-AMP 1 0
5'-ATP 1 3
Никотинамидмононуклеотид Пиридокса ль-5'- фосфат 1 0
1 5
Глюкоза-б-фосфат+NADH 1 8
6- Фосфоглюконат+NADH 1 0
Тетранатрийпирофосфат+NADH 1 0
Глюкоза-б-фос&ат+NAD+ Пиридоксаль-5 -фосфат+NAD+ 1 0
1 14
Таблица 3. Обзор данных по эффективному биоспецифическому элюированин> глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы из L. mesenteroides с колонок с иммобилизованными проционом красным НЕ-ЗВ, цибакроном голубым 3-GA, а также с гелем матрекс оранжевый В
Элюент
Процнон красный НЕ-ЗВ
Степень очистки
Выход, %
Цибакрон голубой 3-GA
Степень очистки
Выход,
Гель матрекс оранжевый В
Степень очистки
Выход,. %
1 мМ NADP+ 10 мкМ NADP+ 60 мкМ NADP+ 1 мМ NADPH 10 мМ NAD+ 1 mM2',5'-ADP 1 мМ G-6-P+1
мМ NADH
16
11 12
8 5
73
59 70
63 30
15
11 11
9 5
82
19 67
70 28
28,2 29,9 40,3 38,4 39,1 21,6
85 80 78 83 74 95
8»
416
Глава 4
tob: NADP+ (ІД 0,1 и 0,05 мМ), NAD+ (10 мМ), NADPH (1 мМ) и 2',5'-ADP (1 мМ). Из многих исследованных элюен-тов лишь несколько оказались эффективными. Так, оба ко-.фермента NAD+ и NADP+, используемые этим специфичным по отношению к двум нуклеотидам ферментом, а также NADPH и 2',5'-ADP десорбировали очищенный фермент. Субстрат и продукт ферментативной реакции (т. е. глюкоза-6-фосфат и 6-фос-фоглюконат) были неэффективными при исследованных концентрациях.
8.3. Изменение ионной силы
Исторически сложился следующий экспериментальный примем: для элюирования использовались буферы с увеличивающейся ионной силой. Незначительные экономические затраты являются весьма веским преимуществом такого метода элюирования. Во многих работах для увеличения ионной силы описало использование KCl или NaCl. Эффективность использования различных солей для элюирования с иммобилизованных красителей и, возможно, с других аффинных колонок оценивалась с помощью коэффициентов вязкости В. С помощью предлагаемых в работе [19] таблиц можно изменять ионную силу элю-<ента в соответствии с пиком элюирования белка; таким образом можно влиять на кривые элюирования, меняя состав и концентрацию соли.
8.4. Изменение растворителя
На связывание макромолекул можно повлиять изменением растворителя. Например, для изменения условий были использованы этиленгликоль и другие спирты; эти эксперименты проводились при разных температурных условиях, в частности при низких температурах (разд. 6) (см. также разд. 8.9). Ниже приведено описание такого эксперимента с использованием эти-ленгликоля.
1) Колонку (2 мл) с иммобилизованным проционом желтым MX-3R (концентрация лиганда 17,2 мг/г геля) уравновешивают 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7,8).
2) Наносят образец (1 мл, 32,2 Е, 8,8 мг) частично очищенной глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы.
3) Колонку промывают уравновешивающим буфером при скорости потока 4 мл/ч и отбирают фракции по 1 мл до тех пор, пока поглощение элюента при 280 нм не станет ниже 0,05.
4) Наносят пульсирующую дозу (10 мл) 50% -ного (об./об.) этиленгликоля в уравновешивающем буфере, после чего через колонку вновь пропускают уравновешивающий буфер.
__Методики эксперимента_П7
Обьем элюата,мл
Рис. 9. Разделение различных ферментов на №-(6-амнногексил)-5'-АМР-се-фарозе с использованием увеличивающегося градиента температуры. 1 — гексокиназа; 2 — глицерокиназа; 3— дрожжевая алкогольдегидрогеназа; 4 — лактатдегидрогеназа H4. Стрелка указывает элюирование пульсирующей дозой 5 мМ NADH [11]. (Воспроизведено с разрешения.)
400C все еще требуется введение пульсирующей дозы 5 мМ NADH.
Таким образом, изменение температуры в сочетании с другими приемами, такими, как уменьшение концентрации лиганда, пульсирующее введение NADH или использование градиентов ионной силы, можно применять при элюировании жестко связанных ферментов. Кроме того, градиенты температуры могут служить очень чувствительными методами элюирования слабо связанных ферментов. Добавим, что элюированные ферменты, не содержащие десорбирующих агентов (например, солей или незначительных количеств нуклеотида), можно непосредственно использовать при кинетических исследованиях.
5) Все фракции контролируют по поглощению при 280 нм и анализируют на ферментативную активность.
6) Фракции объединяют и определяют выход и степень очистки.
8.5. Элюирование путем изменения температуры
В работе [11] показано, что изменение температуры можно использовать с целью элюирования ферментов с аффинных адсорбентов. На рис. 9 приведены результаты разделения дрожжевой алкогольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексокиназы и лактатдегидрогеназы на иммобилизованном 5'-AMP с использованием линейного градиента температуры. Уместно заметить, что глицерокиназа и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюи-руются в порядке, соответствующем их кажущимся энергиям адсорбции с почти количественным выходом (70—90%), в то время как для элюирования лактатдегидрогеназы даже при
