Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 37

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 106 >> Следующая

4) Полученные эпокси-шарики промывают водой до нейтральной реакции промывных вод, а затем несколькими объема* ми 0,5 M фосфата натрия (pH 6,2).
Поперечно-сшивающие агенты
99
5) Сразу после этого шарики отфильтровывают с отсасыванием и добавляют к ним 2,0 M тиосульфат натрия (30 мл).
6) Шарики перемешивают в растворе тиосульфата в течение 6 ч при комнатной температуре, промывают ДТТ (8 мг/мл) в 1 мМ ЭДТА (по крайней мере 2-кратным избытком к содержанию эпоксидов; достаточно 4 мл раствора ДТТ).
7) Через 30 мин при комнатной температуре шарики отделяют от раствора восстановителя путем фильтрования с отсасыванием (водоструйный насос) и последовательно промывают порциями по 30 мл 0,1 M NaHCO3, содержащим 1,0 ммоль/л NaCl и 1 ммоль/л ЭДТА, затем 1 мМ ЭДТА и в заключение О,01 M ацетатом натрия (pH 4,0), содержащим 1 ммоль/л ЭДТА. В процессе промывания важно исключить попадание воздуха в шарики, а также защитить их от дальнейшего окисления на воздухе путем хранения под дегазированным 0,01 M ацетатом натрия (pH 4,0). Поскольку в течение месяца наблюдается уменьшение концентрации свободных тиольных групп на SO% [5], следует осуществлять восстановление шариков непосредственно перед использованием. Шарики, хранившиеся в течение длительного времени, могут быть регенерированы до их исходной емкости восстановлением ДТТ.
10.2.1. Активация восстановленной тиопропил-агарозы.
1) Шарики (для обеспечения максимального содержания сульфгидрильных групп следует использовать свежевосстанов-ленные шарики) промывают водой и затем 50%-ным (об./об.) водным ацетоном.
2) Гель суспендируют в 50%-ном (об./об.) водном ацетоне, содержащем 2-пиридиндисульфид (100 мг), растворенный в минимальном количестве смеси ацетон — вода.
3) Смесь перемешивают в течение 30—60 мин при комнатной температуре, фильтруют и промывают 50%-ным (об./об.) водным ацетоном.
4) В заключение промывают шарики 1 мМ ЭДТА (pH 7,0). В результате активации получают устойчивые во времени шарики, которые можно хранить по крайней мере 6 мес при 4O0C с небольшой потерей активных тиольных групп.
Литература
1. Avrameas S., Ternynck Т., Guesdon J., Scand. J. Immunol., 8, 7 (1978).
2. Wold F., in: Methods in Enzymology, Vol 11, Hirs С. H. W. (ed.), Academic Press Inc., New York and London, 1967, p. 617.
3. Lowe C. R., Dean P. D. G., in: Affinity Chromatography, published by J. Wiley & Sons, London, 1974, p. 234.
4. Hocking J. D., Harris J. /., FEBS Lett., 34, 280 (1973).
5. Axen R., Drevin H., Carlsson Acta Chem. Scand., 29, 471 (1975).
7*
Глава 4.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИГАНДА НА СОРБЕНТЕ
1.1. Дифференциальный анализ
Количество лиганда, присоединенного к гелю (на единицу массы или объема геля), часто определяют по разности между полным количеством лиганда, добавленного в реакционную смесь, и количеством лиганда, возвращенного после интенсивной промывки геля. Во многих случаях такой подход дает вполне удовлетворительные результаты при условии, что содержание лиганда можно количественно определять с помощью чувствительных спектрофотометрических, флуориметрических или радиометрических методов. Кроме этих методов можно использовать также ЯМР- и ЭПР-спектроскопию и гравиметрический анализ.'
1.2. Спектрофотометрия гелей
Если лиганды поглощают при длинах волн >250 нм, то можно определить концентрацию связанного лиганда прямой спектрофотометрией геля. Для этого гель суспендируют в оптически чистом этиленгликоле, глицерине, концентрированном растворе сахарозы или 1%-ном (об./об.) водном полиэтилен-гликоле (polyox WSR 301) и измеряют поглощение приготовленного образца против суспензии той же концентрации немо-дифицированного геля в двухлучевом спектрофотометре. Важно, чтобы гели были тщательно промыты суспензионной средой перед измерением.
1.3. Солюбилизация гелей
Существует ряд методов солюбилизации модифицированных агарозных гелей, что позволяет проводить количественное спект-рофотометрическое определение иммобилизованного лиганда. Модифицированные агарозные гели могут быть солюбилизиро-ваны нагреванием при 75 °С в 1) 0,1 M HCl; 2) 0,1 M NaOH-0,1% (масс/об.) NaBH4 или 3) 50%-ной (об./об.) уксусной кислоте. Для различных препаратов условия солюбилизации меняются; их устанавливают методом проб и ошибок.
МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Методики эксперимента
101
1.4. Кислотный или ферментативный гидролиз
Достаточно жесткая обработка адсорбента с иммобилизо-^ ванным лигандом приводит к гидролизу связи матрица — ли-ганд и выделению лиганда или продукта его деградации, которые можно количественно определить. Как правило, полный гидролиз иммобилизованных на агарозе лигандов может достигаться нагреванием в течение 1 ч при 1000C в 0,5 M HCl. По другой методике, заключающейся в гидролизе в вакууме в 6,0 M HCl в течение 24 ч при HO0C, получают продукты, удобные для аминокислотного анализа, что особенно полезно для аминокислотных и белковых лигандов.
1.5. Элементный анализ
В тех случаях, когда иммобилизованный лиганд содержит особый элемент, достоверное определение концентрации лиганда можно провести с помощью элементного анализа. Так, анализ фосфата удобен для иммобилизованных нуклеотидов и нуклеиновых кислот, а анализ на серу был использован для определения сульфаниламида, присоединенного к CNBr-активирован-ной агарозе [1]. Может быть использован элементный анализ на азот, бром или фосфор, несмотря на то что стадии получения адсорбентов, такие, как бромоцианактивация, включают реагенты, содержащие некоторые или все указанные элементы. Следует отметить, что при проведении CNBr-активации в присутствии фосфатного буфера в агарозные гели может вводиться иммобилизованный фосфат.
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed