Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
104
Глава 4
пример, неприемлемы сорбенты на основе стеклянных и полиакриламидных носителей ввиду быстрого отщепления аффинных лигандов.
3. ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИГАНДОВ
Впервые влияние концентрации лиганда на связывание ферментов с аффинными лигандами было исследовано в работе Харвея с сотр. [5], где было изучено поведение различных ферментов по отношению к иммобилизованному аденозин-5'-моно-фосфату (5'-AMP).
Для полимеров с различной концентрацией иммобилизованного лиганда, однородно распределенного по гелю, связывание фермента, например лактатдегидрогеназы, зависит от концентрации лиганда таким же образом, как и при непосредственном разбавлении аффинного геля незамещенной сефарозой. Более сильное связывание, наблюдаемое с гетерогенными полимерами, отражает, возможно, способ разбавления, так как в этих условиях могут сохраняться участки на колонке, в которых концентрация лиганда все еще остается равной концентрации первоначального неразбавленного геля.
Емкость колонки с Ы6-(6-аминогексил)-5/-АМР-сефарозой по лактатдегидрогеназе при использовании гелей с различными концентрациями ковалентно связанного лиганда меняется по сигмоидальной кривой в зависимости от концентрации лиганда. Эта зависимость отличается от поведения гелей, полученных прямым разбавлением первоначального геля немодифицирован-ной сефарозой (рис. 1). При низких концентрациях лиганда глицерокиназа не связывается с №-(6-аминогексил)-5'-АМР-се-фарозой. Сигмоидальный характер кривой отражает определенную кооперативность во взаимодействии фермента с иммобилизованным лигандом и подтверждает, что при более высоких концентрациях лиганда удерживание фермента на геле проис. ходит благодаря затруднению его диссоциации с матрицы.
Концентрация лиганда может быть использована для тонкого регулирования связывания макромолекулы с аффинной колонкой. Концентрация лиганда, выбранная на основании отдельного эксперимента, вероятнее всего, не будет оптимальной для достижения наилучшего разделения. Это особенно относится к адсорбентам, содержащим фенилборную кислоту. В этих случаях должны быть поставлены несколько экспериментов с различными концентрациями лиганда для окончательного решения вопроса об условиях разделения.
4. ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ КОЛОНКИ
Лове и сотр. [6] исследовали влияние размера колонки на связывание ряда ферментов с иммобилизованным на сефарозе 5'-АМР. При этом работа проводилась в колонках, содержащих
Методики эксперимента
105
Рис. 1. Связывание лактатдегидроге-назы из сердца свиньи с 1Ч6-(6-ами-ногексил) -5 -АМР-сефарозой в зависимости от концентрации лиганда. Образцы (100 мкл) содержали фермент с активностью 5 E и 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина. / — N6-(6-аминогексил)-5'-AMP-сефароза, разбавленная незамещенной се-фарозой до требуемых концентраций лиганда; 2 — №-(6-аминогек-сил)-5'-АМР, однородно присоединенный к сефарозе 4В с указанной концентрацией лиганда. Нулевое разбавление эквивалентно концентрации лиганда 1,5 мкмоль 5'-АМР/мл сефарозы. Прочность связывания ? оценивалась по концентрации KCl (ммоль/л), необходимого для элюи-рования фермента. (Воспроизведено с разрешения.)
Кратность разбавления
один и тот же сорбент с постоянной концентрацией на нем лиганда, а также при постоянном суммарном количестве лиганда в колонке; менялась только длина упакованного геля (увеличивалась в 60 раз путем 4-кратного уменьшения диаметра колонки). Была изучена зависимость удерживания ферментов в колонке от длины (высоты) колонки. На рис. 2 показано, что при увеличении длины колонки с Ы6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефа-розой связывание дрожжевой алкогольдегидрогеназы и глице-рокиназы достигает максимального (предельного) значения.
При графическом представлении экспериментальных данных по элюированию в обратных координатах наблюдаются два максимума при концентрации KCl в элюенте 830 и 420 ммоль/л; половинное (от максимального) связывание в случае дрожжевой алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы соответствует длине колонки 25 и 15 мм.
5. ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА И ВРЕМЕНИ ИНКУБАЦИИ
С использованием одного и того же аффинного адсорбента АМР-агарозы в работе [6] изучено также влияние скорости потока и времени инкубации на связывание лактатдегидрогеназы при низкой концентрации фермента (0,6 Е/мл). На рис. 3 показано, что в условиях бетч-процесса имеет место быстрое уве-
€00 г
Длина колонки, мм
Рис. 2. Влияние длины колонки при постоянных концентрации и содержании лиганда на связывание двух ферментов с №-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозой. Образец (100 мкл), содержащий фермент (5E) и бычий сывороточный альбумин (1,5 мг), наносили на колонки (различных диаметров: б, 9, 13,5 и 23 мм) с №-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозой (2,0 г влажного носителя, 1,5 мкмоль 5'-АМР/мл). Связывание ? оценивалось как концентрация KCl (ммоль/л) в центре пика фермента при его элюировании линейным градиентом KCl. Бычий сывороточный альбумин, который элюиро-вали уравновешивающим буфером, дрожжевую алкогольдегндрогена-зу (J) и глицерокиназу (2) анализировали методами, указанными в работе [6].
