Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
11) Аминоарил-целлюлозу вновь суспендируют в 0,1% (об./об.) водном растворе NaN3 и хранят при 40C в темноте.
9.4. Диазотирование аминоарил-целлюлозы и присоединение белков
Внимание! Реакции проводят в хорошо работающем вытяжном шкафу.
1) Суспензию целлюлозы (полученную по методике, описанной в разд. 9.3) тщательно перемешивают и отбирают объем,, содержащий ~ 1 г целлюлозы.
2) Суспензию переносят на пористый стеклянный фильтр (например, Schott & Gen, Mainz; 3D-3), удаляют воду путем отсасывания и тщательно промывают целлюлозу дистиллированной водой (3 раза по 40 мл).
Глава З
3) Целлюлозу тщательно сушат на фильтре с отсасыванием, а затем суспендируют в 0,1 M HCl (30 мл), предварительно охлажденной до 0-ь4°С.
4) Суспензию эффективно перемешивают, поддерживая температуру 0-М 0C
5) К суспензии прибавляют предварительно охлажденный (0ч-4°С) 1,0 M NaNO2 (3 мл); перемешивание продолжают в течение 45 мин, поддерживая температуру 0ч-4°С.
6) Реакционную смесь переносят на пористый стеклянный фильтр; продукт — диазотированную аминоарил-целлюлозу — тщательно промывают предварительно охлажденной (0-е-4°С) дистиллированной водой, пока pH фильтрата не станет равным pH дистиллированной воды (6,0н- 7,0).
7) Целлюлозу промывают охлажденным (0—40C) боратным буфером (2 раза по 40 мл).
8) Для приготовления боратного буфера растворяют H3BO3 (12,36 г) и NaCl (2,92 г) в дистиллированной воде (900 мл), прибавляют 1,0 M раствор NaOH (55,2 мл), доводят pH до 8,6 1,0 M NaOH или HCl и доводят общий объем до 1 л.
9) Целлюлозу отфильтровывают и суспендируют в соответствующем растворе белка (растворы для присоединения не должны содержать азид натрия). Белок должен быть растворен в указанном выше боратном буфере; в случае антител барана против IgG кролика используют ~ 100 мг IgG/r целлюлозы.
10) Для достижения максимальной эффективности присоединения используют наименьший возможный конечный объем реакционной смеси; вместе с тем должна быть обеспечена возможность гомогенного перемешивания (магнитная или роллер-ная мешалка).
11) Через 5—10 мин к реакционной смеси прибавляют 30%-ный (масс/об.) NaCl (1 мл) и проводят реакцию присоединения белка в течение 20—22 ч при 4 °С.
12) Производное целлюлозы отфильтровывают через пористый фильтр и дважды промывают на фильтре дистиллированной водой (2 раза по 40 мл).
13) Измеряют объемы каждого из трех фильтратов и определяют содержание в них белка; это позволяет достаточно точно рассчитать степень присоединения белка.
14) Промывают адсорбент на фильтре двумя последовательными порциями по 40 мл раствора ?-нафтола (при комнатной температуре); при этом блокируется избыток диазониевых групп, что приводит к получению окрашенной в оранжевый цвет целлюлозе.
15) Раствор ?-нафтола используется свежеприготовленным Готовят его так: 0,75 г ?-нафтола прибавляют к 1 л боратного буфера (состав указан выше). Суспензию перемешивают в тече*
Поперечно-сшивающие агенты
95
ниє 1 ч при комнатной температуре в темноте, а затем фильтруют.
16) Остаток на фильтре промывают двумя порциями по 40 мл боратного буфера и затем тремя порциями по 40 мл фосфатного буфера; производное целлюлозы суспендируют в том же буфере и хранят при 4 °С.
17) Для приготовления фосфатного буфера в 1 л дистиллированной воды растворяют мертиолат натрия (1 г) или азид натрия (Ir), Na2HPO4-2H2O (2,46 г), KH2PO4 (0,72 г), NaCl (1,125 г) и Na2(SATA) •2H2O (2,0 г).
18) Определение содержания производного целлюлозы в суспензии выполняют по методике, описанной в разд. 9.2.
9.5. Присоединение гонадотропина хориона человека к сефарозе CL 4В с использованием активации реакционноспособным азокрасителем
Присоединение осуществляют в соответствии со схемой последовательных реакций, представленной на рис. 1.
9.5.L Присоединение реакционноспособного красителя к сефарозе CL 4В.
1) К сефарозе CL 4В (25 г отфильтрованного геля) прибавляют левафикс бриллиантовый красный Е-4ВА (фирма Bayer; 125 мг), растворенный в дистиллированной воде (12,5 мл).
2) Поднимают температуру реакционной смеси при постоянном перемешивании до 40 °С.
3) Прибавляют твердый NaCl (2,29 г) и перемешивают суспензию в течение 30 мин при 40 0C
4) Прибавляют твердый безводный Na2CO3 (1,4 г) и перемешивают суспензию в течение 90 мин при 4O0C
5) Производное краситель-сефароза отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре и тщательно промывают дистиллированной водой; измеряют поглощение при 512 нм объединенных фильтратов (в 1-см кюветах).
6) Степень присоединения красителя (в процентах) можно рассчитать, принимая поглощение 1%-ного раствора левафикса бриллиантового красного Е-4ВА в указанных условиях равным 176.
7) Окрашенную сефарозу суспендируют в 0,2 M водном эта-ноламине (30 мл), предварительно доведенном до pH 10,0 концентрированной HCl, суспензию перемешивают в течение 30 мин при 400C
8) Сефарозу отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой, пока pH фильтрата не станет равным 6-^7.
96
Глава З
реакционкоспособ-
0¦0H ..,.""а,..., » Ar-N=N-Ar-^N:V0"^
