Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 30

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 106 >> Следующая

4) Добавляют еще 5,85 г ЭДАК, как в предыдущей стадии,, и продолжают перемешивание при контролируемом pH в течение 4 ч после окончания добавления.
5) Переносят суспензию на воронку Бюхнера (№ 4A) с фильтром (бумага Whatman № 1). Промывают шарики на воронке 8 л 0,1 M NaCl, увеличивая промежутки времени между последовательными порциями (без отсасывания). Продолжают промывание 4 л 0,4 M NaCl тем же способом и в заключение промывают еще 4 л 0,1 M NaCl.
6) Хранят полученный АЭКМ-гель в 0,1 M NaCl, содержащем 0,04% (масс/об.) азида натрия, при 40C
Автор хранил шарики поперечно-сшитой АЭКМ-агарозы в течение длительного времени (~6 мес.) при —200C после замены 0,1 M NaCl на 2-пропанол; для этого гель тщательно промывали на воронке Бюхнера несколькими объемами 25, 50 и 75%-ного (об./об.) 2-пропакола в дистиллированной воде и в заключение 100%-ным 2-пропанолом. При необходимости отбирают аликвоты (2-пропанол не замерзает при —20°С), нагревают до комнатной температуры и промывают требуемым буфером.
11.2.4. Определение содержания аминогрупп. Навеску АЭКМ-агарозы обрабатывают избытком СПТП [19] в смеси буфер — растворитель для превращения всех аминогрупп в 2-пиридил-дитиопропионамидные группы. Последующая обработка избытком дитиотреитола (ДТТ) приводит к восстановлению образовавшейся дисульфидной связи и переходу пиридин-2-тиона в раствор; его концентрация измеряется спектрофотометрически (ємакс = 8080 при 343 нм) [19].
1) Навеску АЭКМ-агарозного геля (3,5ч-4 мл упакованного объема) переносят на небольшую воронку Бюхнера с фильтром (бумага Whatman № 1).
6—139
82
Глава 2
2) Промывают 0,1 M NaCl и вторым буфером (разд. 11.2.1). Готовят суспензию в 8 мл этого буфера.
3) Растворяют 9 мг СПТП в 0,5 мл Ы^-диметилформамида и добавляют этот раствор к приготовленной суспензии. Перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение ?0 мин (можно использовать магнитную мешалку).
4) Гель промывают на воронке Бюхнера тем же буфером, 0,1 M NaCl и в заключение основным буфером с pH 7,6 (см. разд. 11.2.1).
5) Далее анализ проводят с двумя пробами параллельно; для этого по 1,0ч-1,5 мл упакованного объема геля, полученного на стадии 4, помещают в две силиконизированные аналитические пробирки (10X75 мм), используя основной буфер с pH 7,6 в качестве среды. Гели упаковывают путем центрифугирования в течение 2 мин при приблизительно 1500 g. Пробирки оставляют по крайней мере на 10 мин, отмечают положение верхней поверхности геля для последующего измерения объема. Жидкость над осадком удаляют.
6) Готовят свежий 0,2 M раствор ДТТ в основном буфере с pH 7,6. Добавляют равный объем этого раствора к каждой навеске геля; периодически смеси перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре.
7) Количественно переносят каждую суспензию в мерные цилиндры объемом 25 мл и доводят до метки основным буфером с pH 7,6. Перемешивают несколько минут для диффузии с шариков отщепившегося пиридин-2-тиона.
8) Гели, полученные на предыдущей стадии, центрифугируют для осаждения всех шариков. Измеряют поглощение (в 1-см кювете) прозрачного раствора над носителем при 343 нм против буфера.
9) Рассчитывают концентрацию (плотность) реакционно-способных аминогрупп с использованием уравнения:
мкмоль/мл геля = 25Л343/(8,08-мл геля)
Описанная выше методика получения АЭКМ-сефарозы CL 4В приводит к продукту, содержащему 1,40 мкмоль аминогрупп/ /мл геля. Гели с более высоким или более низким содержанием аминогрупп можно получить пропорциональным изменением времени реакции карбоксиметилирования (причем для получения гелей с более высоким содержанием аминогрупп надо увеличивать время в большей степени, чем это следует из расчета).
11.3. Заключительные замечания
В приведенных выше методиках описывается практический подход к первоначальной функционализации агарозных шариков для последующего получения специфических аффинных ад-
Методы активации
сорбентов. Плотность карбоксильных, амино- или тиольных (сульфгидрильных) групп лучше всего можно контролировать, подбирая время и температуру первой реакции [уравнение (1)]; следующая реакция [уравнение (2)] и реакция тиолиро-вания при аналитическом эксперименте (разд. 11.2.4) протекают по существу количественно. Этот подход приводит к удобным иммобилизованным функциональным группам, присоединенным к твердому носителю через абсолютно стабильные незаряженные гидрофильные связи.
Последующее присоединение специфических лигандов может быть осуществлено многими способами, включая активацию КМ-производного водорастворимым карбодиимидом, аци-лирование АЭКМ-формы или алкилирование АЭКМ-амино- или 3-меркаптопропионамидных групп. Конечную плотность лиганда можно контролировать концентрацией КМ-групп, если все последующие реакции протекают количественно, или, кроме того> степенью заключительной модификации. В последнем случае обычно целесообразно блокировать остающиеся функциональные группы (например, заряженный протонированный амин). Незамещенные аминогруппы можно ацетилировать; SH-rpyn-пы могут быть алкилированы иодоацетамидом при pH 8,0 предпочтительно сразу после восстановления спонтанно образующихся дисульфидных связей.
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 106 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed