Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
3) Медленно перемешивают (мешалка подвесного типа) и по каплям прибавляют пиридин (7 мл).
4) Реакционную смесь перемешивают (мешалка переворачивающего типа) при комнатной температуре в течение 2 ч.
5) Шарики тщательно промывают ацетоном, водно-ацетоновой смесью и водой (растворители берут в обратном порядке по сравнению с тем, как описано в п. 1).
10.2.2. Присоединение.
1) К полученным шарикам (разд. 10.2.1) добавляют 1,5 M раствор амина в 0,5 M NaHCO3 (pH 10,7 после добавления амина; 50 мл).
2) Суспензию перемешивают при 4O0C в течение 16—48 ч.
3) По окончании присоединения (периодически отбирают аликвоту и контролируют спектрофотометрически отщепление тозильных групп) носитель отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре и промывают последовательно (по 500 мл) водой, 1 мМ HCl, 1,0 M NaHCO3 и вновь водой.
Методы активации
77
11. ВВЕДЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП В АГАРОЗНЫЕ ШАРИКИ ПУТЕМ КАРБОКСИМЕТИЛИРОВАНИЯ И ОБРАЗОВАНИЯ АМИНОЭТИЛАМИДНОГО ПРОИЗВОДНОГО
Дж. Инман (J. К. Inman) ПЛ. Введение
Первоначальная функционализация агарозных шариков для получения аффинных адсорбентов часто осуществлялась путем их активации бромоцианом. Реакционноспособные цианатные эфиры и имидокарбонатные группы образуют главным образом изомочевинные связи с аминогруппами белков или других ли-гандов [12]. В обычных условиях применения такого рода сорбентов эти связи оказываются протонированными (и, следовательно, заряженными) и неустойчивыми при действии нуклео-филов (например, ОН"). Таким образом могут иметь место неспецифические ионные взаимодействия, а присоединенные ли-ганды постепенно отщепляются от носителя. Было предложено несколько других подходов к функционализации полисахарид-ных матриц [13—16], лишенных указанных недостатков.
Далее описан один из таких путей, начинающийся со стадии введения стабильных карбоксиметильных групп через простую эфирную связь в шарики поперечно-сшитой агарозы. Затем концевые карбоксильные группы могут активироваться и вводиться в реакции конденсации со специфическими лигандами или вставками или же превращаться в первичные аминогруппы реакцией с этилендиамином, как описано в разд. 11.2.3.
Карбоксиметилирование носителей с первичными или вторичными гидроксильными группами можно осуществить классическим синтезом простых эфиров по Вильямсону, что было продемонстрировано Петерсоном и Собером [17] в случае KM-целлюлозы. Вицинальная конфигурация диолов не обязательна, и метод применим ко всем полигидроксилированным матрицам, выдерживающим обработку сильной щелочью в течение нескольких часов, таким, как целлюлоза, агароза, поперечно-сшитые декстраны, поли(гидроксиэтил)метакрилаты или поливиниловые спирты. Реакция проводится с хлороуксусной кислотой в избытке водного едкого натра:
Для большинства целей достаточна модификация лишь небольшой части гидроксильных групп. В описанной ниже мето-
о
и
+ Cl-CH2C-O"
NqOH
KM-агароза
(і)
78
Глава 2
дике применяется большой избыток хлороацетата для уменьшен ния времени воздействия на матрицу сильной щелочи и обеспечения кинетики приблизительно первого порядка. Последнее обстоятельство позволяет легко контролировать концентрацию вводимых КМ-групп путем проведения реакции в течение определенного времени и выбора подходящей температуры [18]. Основной побочной реакцией, не затрагивающей матрицу, является превращение хлороацетата в гликолят в результате атаки на ионы гидроксила. В приведенной здесь методике лишь ~12% реагента теряется подобным образом к моменту окончания реакции карбоксиметилирования. На следующей стадии может быть получен носитель с первичными аминогруппами:
Для обеспечения одноточечного присоединения этилендиамина к носителю используется очень большой избыток этого реагента: образуется единственная амидная связь, а вторая аминогруппа остается свободной. В качестве конденсирующего агента применяется водорастворимый карбодиимид (хлорогид-рат 1-этил-З- (3-диметиламинопропил) карбодиимид, ЭДАК). Как показано на схеме реакции [уравнение (2)], этилендиамин реагирует в форме, содержащей одну протонированную аминогруппу; однако большинство молекул протонировано по обеим аминогруппам при контролируемом pH, равном 4,6. Близко расположенный положительный заряд на другом атоме азота понижает рКа реагирующей аминогруппы до значения ~7,1. Таким образом, при pH 4,6 реакционноспособность этой аминогруппы значительно повышается по сравнению с аминогруппой, остающейся после присоединения (р/Са~9,2), что является дополнительным фактором, способствующим одноточечному связыванию с матрицей. Более 90% карбоксильных групп могут быть превращены в аминоэтилкарбамилметил-производное (АЭКМ-производное).
В результате реакций по уравнению (1) и (2) получают ами-носодержащие матрицы с простой гидрофильной структурой, полностью устойчивые в обычно используемых в аффинной хроматографии условиях. Стадия дополнительной модификации^ описанная в разд. 11.2.4, приводит к тиол-матрице (3-меркапто-пропионил-АЭКМ-агарозе), которая также может быть использована для получения специфических адсорбентов. Структура последней может быть представлена как HS-CH2CH2-CO-АЭКМ-агароза. Незаряженная 9-атомная вставка относительно гидрофильна, поскольку включает лишь две соседние СН2-груп-пы и не содержит ароматической структуры.
