Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
8) Хранят гель в 0,05%-ном (масс./об.) растворе NaN3 при 40C
По данным элементного анализа адсорбент содержал 108 мкмоль лиганда на 1 г сухого геля.
6. КАРБОНИЛДИИМИДАЗОЛЬНАЯ АКТИВАЦИЯ
Полисахаридные матрицы могут активироваться с использованием карбонилирующих агентов общей формулы:
Y I
O=C-X
где Y — группа, легко замещаемая амином, а X — та же группа,, что и Y, или другая подходящая также замещаемая группа, которая связывается с атомом водорода в процессе карбонилиро-вания. Карбонилирующими реагентами могут служить N,N'-карбонилдиимидазол (КДИ), ^№-карбонилди-1,2,3-бензотри-азол (КБТ) или ^№-карбонилди-1,2,4-триазол (КДТ).
6.1. Активация сефарозы CL 6В карбонилдиимидазолом
1) Сефарозу CL 6В (3 г влажного геля) последовательно промывают (по 50 мл) водой, водно-диоксановой смесью [(3:7} (об./об.), затем (7:3) (об./об.)], диоксаном и суспендируют в диоксане (5 мл).
2) Добавляют КДИ (0,12 г). Реакционную смесь из сефарозы и КДИ можно оставить на 0,25—6 ч в зависимости от времени проведения последующих стадий промывания и присоединения, причем выходы реакции идентичны в указанных интервалах времени. Это отличает данный метод активации от GNBr-метода, при котором необходимо проводить стадию присоединения как можно быстрее. Кроме того, степень активации можно значительно увеличить при использовании большего количества КДИ.
3) После активации носитель промывают диоксаном (100 мл) и используют немедленно.
6.2. Присоединение лигандов к активированным матрицам
Обрабатывают активированную матрицу в течение ночрг н-бутиламином(1,4 г) в воде (9 мл) при pH 10 и последовательно промывают водой (200 мл), 1,0 M NaCl (100 мл) и водой (200 мл). По стоимости и емкости КДТ- и КБТ-активиро-
64
Глава 2
ванные матрицы по сравнению с КДИ-матрицами не обладают, по-видимому, какими-либо преимуществами, кроме большей скорости присоединения. КДИ-активация сравнима в какой-то мере с распространенным CNBr-методом, но более удобна в экспериментальном отношении.
Одно из наиболее значительных преимуществ методов, основанных на применении карбонилирующих реагентов, по сравнению с CNBr-методом заключается в том, что в ходе стадии присоединения на матрицу не вводятся заряженные группы.
6.3. Рекомендованный метод для применения коммерчески доступной КДИ-активированной агарозы
КДИ-активированная 6%-ная поперечно-сшитая агароза производится фирмой Pierce Chemical Company под торговым названием «реактигель» (6X) [Reacti-Gel (6X)]. Этот продукт представляет собой 6%-ную поперечно-сшитую сферическую агарозу, модифицированную КДИ с образованием высокоактивированной имидазолилкарбаматной матрицы.
6.3Л. Методика присоединения. Присоединение белков осуществляется главным образом через доступные а- и е-аминогруп-пы. Белки могут быть присоединены непосредственно путем многоточечного связывания с носителем или с использованием вставки. Для белков, лабильных при рН^9, реакцию присоединения можно проводить при pH 8,5 в 0,1 M боратном буфере. Если и эти условия непригодны для белка, то присоединение можно осуществить через вставку в присутствии водорастворимого карбодиимида (pH 4,5-^5,5; 24 ч; комнатная температура).
1) Избыток ацетона из реактигеля (6X) удаляют путем осторожного отсасывания на пористом стеклянном фильтре. При этом ацетон не должен больше капать с влажного остатка, но не следует высушивать гель полностью.
2) Влажный реактигель (6X) измельчают.
3) Добавляют гель в буфер, содержащий лиганд.
4) Для белков, чувствительных к небольшим количествам ацетона, перед использованием гель отмывают от растворителя путем быстрого промывания требуемого количества геля несколькими объемами ледяной воды.
Бычий тиреоглобулин, бычий тиреоидстимулирующий гормон, инсулин свиньи и человеческий иммуноглобулин могут быть успешно присоединены к реактигелю (6X) с 87—100%-ным выходом и, как было показано, сохраняют свою биологическую активность в указанных условиях присоединения.
Выпускается также КДИ-активированный поперечно-сшитый декстран-реактигель (25DF) в виде шариков (фирма-производитель Pierce Chemical Company).
Методы активации
65
7, АКТИВАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА СМЕШАННЫХ АНГИДРИДОВ
Приведенная ниже методика применяется в первую очередь для активации лиганда, а не матрицы (разд. 7.1). В разд. 7.2 аналогичная химическая методика применена для карбокси-лированных матриц, которые можно модифицировать в безводных условиях (например, карбокси-эупергит С, который может быть получен обработкой эупергита С глицином).
7.1. Получение 17^-эстрадиол-6-(0-карбоксиметил)оксима— БСА
1) ^-эстрадиол-6-(0-карбоксиметил)оксим (180 мг) и три-w-бутиламин (0,22 мл) растворяют в сухом диоксане (7,5 мл); раствор охлаждают во льду.
2) К этой смеси добавляют изобутилхлорокарбонат (55мкл) и оставляют реакционную смесь на 30 мин, поддерживая температуру <10°С.
3) Добавляют раствор БСА (0,58 г) в щелочном водно-ди-оксановом растворе (15,3 мл воды+10,3 мл диоксана+0,58 мл 1,0 M NaOH); реакцию продолжают в течение 4 ч при 5—10°С, поддерживая pH 8,0 с помощью NaOH.
