Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Высокая (~300 ммоль/г) 4 10 4
6 15 6
Умеренная (140 ммоль/г) 4 0,8 0,8
6 1,2 1,2
Слабая (100 ммоль/г) 4 0,6 0,2
6 0,7 0,3
К поперечно-сшитой агарозе (например, сефарозе CL) присоединяется только 25—30% количества лиганда, присоединенного к обычной агарозе.
8) Реакционную смесь осторожно встряхивают или перемешивают при 0—4 0C в течение ночи.
Для обеспечения модификации всех активированных гидро-ксильных групп агарозы непрореагировавшие цианаты могут быть блокированы встряхиванием шариков с 1,0 M глицином <рН 8,0) в течение 6—12 ч при 0°С.
2. МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА АКТИВАЦИИ ОКСИРАНАМИ
2.1. Введение
Бисоксираны, такие, как диглицидиловый эфир 1,4-бутан-диола (рис. 3), при щелочных pH легко взаимодействуют сгид-рокси- и аминосодержащими гелями с образованием производных с иммобилизованным через длинную гидрофильную вставку реакционноспособным оксираном (эпоксидом), который в
CH2-CH-CH2-O-CH2CH2CH2CH2-O-CHj-CH-CH2
\ О
Рис. 3. Диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола.
Методы активации
53
свою очередь может реагировать с нуклеофильными лигандами (аминами, фенолами и т. д.); при этом образуются биоселективные адсорбенты, характеризующиеся минимальным содержанием гидрофобных и ионных групп. Лиганды, присоединенные к оксирановым группам, широко используются и чрезвычайно устойчивы, а применение длинноцепочечного бисоксира-нового реагента обеспечивает введение длинной гидрофильной вставки между лигандом и поверхностью матрицы, что в некоторых случаях может быть полезным.
Эпоксидактивированная сефароза поставляется фирмой Pharmacia, а оксиран-акриловые шарики (эупергит С)—фирмой Rohm Pharma (гл. 1, табл. 3).
2.2. Оксирановая активация агарозы
1) Шарики агарозы (10 г) тщательно промывают дистиллированной водой; избыток воды удаляют фильтрованием через пористый стеклянный фильтр.
2) Промытый гель суспендируют в 1,0 M NaOH (5 мл), добавляют 5 мл диглицидилового эфира 1,4-бутандиола; смесь осторожно встряхивают (или перемешивают) в течение 5— 10 ч при комнатной температуре.
3) Активированный гель тщательно промывают дистиллированной водой и хранят при 4 °С.
Поскольку содержание оксирановых групп при хранении медленно уменьшается, активированный гель надо использовать по возможности быстрее. Сообщалось, что при соблюдении вышеуказанных рекомендаций уменьшения содержания ре-акционноспособных групп не происходит (или происходит в незначительной степени) в течение недели и даже более того [4]; однако в присутствии щелочи разложение оксирана ускоряется.
Гели с различным содержанием оксирановых групп могут быть получены при разной продолжительности реакции или при введении разного количества бисоксирана. К оксиранактивиро-ванной агарозе могут легко присоедняться амины, гидроксилы и другие нуклеофилы.
2.2.1. Присоединение к оксиранактивированной агарозе.
1) Оксиранактивированную агарозу (3 г) суспендируют в 0,2 M Na2CO3 (2 мл; pH 11), содержащем амин (1,58 ммоля).
2) Смесь оставляют при 40C в течение 15 ч и затем промывают 1,0 M NaCl.
3) Для удаления избытка эпоксидагель выдерживают в течение 1 недели в №2С03-буфере (pH 11^-12) или подвергают длительной обработке концентрированным гидроксиламином при нейтральном pH. Предлагается также гораздо более кратковременная обработка оксиранактивированной агарозы (4—
54
Глава 2
6 ч при pH 7,5) меркаптанами (2-меркаптоэтанолом, этандитио-лом или тиомочевиной), которая приводит к полному удалению избыточных реакционноспособных эпоксидных групп.
В процессе присоединения следует исключить присутствие цистеина, тиосульфата и тиогликолевой кислоты, так как в противном случае продукт содержит ионные группы.
2.2.2. Рекомендованная фирмой Pharmacia методика присоединения к эпоксиактивированной сефарозе 6В.
1) Берут навеску эпоксиактивированной сефарозы 6В.
2) Взятую навеску промывают и оставляют для набухания в дистиллированной воде на пористом стеклянном фильтре.
3) Готовят раствор лиганда.
4) Раствор лиганда перемешивают (используя качалку) с суспензией геля в течение 16 ч при 25—4O0C (водяная баня). Не следует применять магнитную мешалку.
5) Избыток лиганда отмывают, используя раствор для присоединения, затем промывают дистиллированной водой, 0,1 M бикарбонатным буфером (pH 8,0) и в заключение 0,1 M ацетатным буфером (pH 4,0).
6) Избыточные группы блокируют путем обработки 1,0 M этаноламином в течение ночи.
7) Избыток этаноламина отмывают и хранят продукт при 4—8 °С.
2.2.3. Замечания.
1) Раствор для присоединения. По возможности надо использовать дистиллированную воду или водные буферные растворы. Нельзя применять глициновые или другие нуклеофиль-ные буферы, так как они могут реагировать с оксирановыми группами. Вполне подходят хорошо оправдавшие себя карбонатный, боратный или фосфатный буферы. Для доведения pH растворов до высоких значений можно использовать раствор гидроксида натрия.
Лиганд должен быть предварительно растворен в буфере для присоединения. Для полного растворения лиганда можно добавлять некоторые органические растворители, например диме-тилформамид и диоксан вплоть до концентрации 50% (об./об.) в конечной смеси. При необходимости pH водной фазы должен быть доведен до нужного значения после растворения лиганда. Органические растворители обычно вызывают понижение pH; следует использовать pH-индикаторную бумагу, так как органические растворители могут повредить электроды.
