Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
б*
68
Глава 2
для инактивации непрореагировавших групп геля. При сравнении модифицированных различными методами углеводных матриц было обнаружено, что неспецифическое связывание вызывается использованием методов активации, при которых в матрицу вводятся заряженные группы [5]. Активация бромоцианом приводит к образованию заряженных изомочевинных групп; получаемые при этом методе сорбенты обладают рядом недостатков. Существенное улучшение свойств сорбентов было обнаружено при работе с матрицами аффигелевого типа (Affi-GeI), в которых активированные эфиры карбоновых кислот присоединяются к агарозной матрице простыми эфирными связями. Единственный недостаток этих матриц, однако, заключается в легком гидролизе активных групп, что может приводить к очень низкому выходу на стадии присоединения.
Ранее был описан активированный периодатом сефадекс (G-50 или G-75) [6]. После присоединения иммуноглобулина и восстановления шиффовых оснований полученные иммуноад-сорбенты характеризовались очень низким неспецифическим связыванием, но гели оказались механически весьма неустойчивыми и быстро забивались. Кроме того, гели имели очень низкую емкость, потому что антитела исключались из внутреннего объеме шариков. Хотя агароза имеет больший размер пор, этот гель активируется периодатным окислением в незначительной степени, так как реакция протекает только по концам цепей полисахаридных молекул. Однако периодатным окислением может быть активирована поперечно-сшитая агароза. В результате побочной реакции, сопровождающей процесс поперечной сшивки с эпихлорогидрином, на геле образуются гликоли. Периодатное окисление этих гликолей приводит к альдегидам, которые могут реагировать с аминогруппами белка. Образовавшиеся шиффовы основания могут быть далее восстановлены, как описано для других матриц. Иммуносорбенты, полученные таким путем, характеризуются очень хорошими хроматографи-ческими свойствами, сочетая жесткость агарозных шариков с химической стабильностью и низким неспецифическим связыванием. Могут быть достигнуты высокие скорости потока даже при использовании таких хаотропных агентов, как 6,0 M солянокислый гуанидин [7].
8.4. Присоединение антител и антигенов к окисленной с помощью периодата сефарозе CL 6 В
8 A.L Предварительная обработка геля.
1) Сефарозу CL 6В промывают на пористом стеклянном фильтре дистиллированной водой (5—10 объемов).
2) Удаляют большую часть воды, удерживаемой гелем.
Методы активации
69
3) 35 г сефарозы помещают в полиэтиленовую колбу объемом 200 мл.
4) Добавляют 0,07 M раствор периодата натрия (70 мл) в^ воде и медленно перемешивают реакционную смесь в течение 45 мин при комнатной температуре.
5) Добавляют 2,0 M раствор этиленгликоля и продолжают перемешивание еще 30 мин.
6) Гель отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре и промывают водой, а затем 0,01 M натрийбикарбонатным буфером (pH 9,5).
7) Рассчитанное количество геля вносят в раствор присоединяемого белка.
8.4.2. Приготовление растворов белков для присоединения. Белки растворяют в буфере, содержащем 20 ммоль/л фосфата и 0,13 моль/л хлорида натрия (pH 7,4). Добавляют 0,2 M раствор карбоната натрия до концентрации 0,01 моль/л и доводят pH до 9,5 с помощью NaOH. Концентрация белка должна быть в интервале 5—30 мг/мл.
8.4.3. Присоединение белков к активированному гелю.
1) Активированную сефарозу (1-М,5 г) прибавляют к раствору белка (1 мл), полученному, как описано выше; при этом суспензия должна оставаться не очень густой и легко перемешиваемой.
2) Реакцию продолжают в течение 48 ч, медленно вращая колбу при 4—8 0C
3) Непрореагировавший белок удаляют с геля путем фильтрования и промывания ледяным буфером, в котором готовился раствор белка (pH 7,4; см. разд. 8.4.2).
4) Жидкость, удерживаемую между частицами геля, отжимают.
5) Для восстановления шиффового основания и оставшихся альдегидных групп добавляют свежеприготовленный раствор борогидрида натрия, содержащего 1 мг NaBH4 на 1 мл того же буфера (2 мл/г геля).
6) Реакцию продолжают при медленном перемешивании в течение 1 ч в холодном помещении.
7) Гель промывают буфером (pH 7,4), затем хаотропным агентом, используемым в последующем эксперименте по имму-ноадсорбции.
8) После тщательного промывания буфером (pH 7,4) гель готов к применению.
8.4.4. Определение выхода на стадии присоединения (щелочной гидролиз и реакция с нингидрином).
1) После обработки хаотропным агентом и тщательного промывания фосфатным буфером (pH 7,4) берут две навески
70
Глава 2
(по 300 мг) геля (после удаления большей части жидкости, удерживаемой гелем) в одинаковые аналитические пробирки.
2) К навескам добавляют тот же буфер (0,1 мл) и 1,0 M NaOH (3 мл).
3) Смесь оставляют при 37 °С в течение 20 ч, поддерживая шарики геля в суспендированном состоянии встряхиванием.
4) Проводят несколько контрольных опытов с немодифици-рованной сефарозой, для чего к навескам сефарозы добавляют одни и те же объемы растворов белка (по ОД мл раствора) в буфере с pH 7,4 (обычно бычьего сывороточного альбумина), содержащие разные количества белка (например, 0, 0,2, 0,4,t),8, 1,2 и 2,0 мг).
