Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Сухая активированная
сферическая целлюлоза раствор белка
I__I
Оперемешивание 2-34
при комнатной
температуре 2)промывакие
t
белок,связанный с матрицей
Рис. 7. Присоединение альбумина к полиизоцианатактивированной сферической целлюлозе.
і '001
Время реакции, ч
Рис. 8. Зависимость реакции альбумина с полиизоцианатактивированной сферической целлюлозой от времени. Предварительно активированную по-лиизоцианатом сферическую целлюлозу (1 г) промывали 0,1 M HCl и добавляли к растворам с тремя различными концентрациями альбумина из сыворотки быка. Через указанные промежутки отбирали аликвоты и определяли концентрацию альбумина. Содержание альбумина (мг) в 100 мл раствора: / — 26,4; 2 — 16,9; 5 — 8,6.
74
Глава 2
5000
Активность уреазы в растворе для присоединения, Е/г
Рис. 9. Зависимость активности уреазы, иммобилизованной на сферической целлюлозе, от активности в исходном растворе для присоединения.
центрации уреазы в растворе для присоединения (рис. 9). Продукт терял активность менее чем на 30% после 1 года хранения в 50%-ном глицерине при 4 °С. Было проведено сравнение полиизоцианатного метода активации применительно к трем носителям: сферической целлюлозе, НА-ультрогелю (IBF-Reac-tifs, Франция) и полигидрокси-стеклу. Уреаза и альбумин были присоединены к этим носителям и к эупергиту С (Rohm Pharma GmbH). В табл. 7 показаны преимущества изоцианат-активированного материала; при этом сравнивались ферментативная активность и количество связывавшегося с матрицей альбумина. Кроме того, для полиизоцианатактивированных носителей не наблюдалось зависимости от концентрации буфера. Сравнение других поставляемых в продажу гелей с иммобилизованными ферментами представлено в табл. 8.
10. ИММОБИЛИЗАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОРГАНИЧЕСКИХ СУЛЬФОНИЛХЛОРИДОВ
10.1. Введение
Органические сульфонилгалогениды взаимодействуют с ал-килгидроксисоединениями с образованием сульфонильных эфи-ров, которые представляют собой удобные уходящие группы. Нуклеофилы могут замещать сульфонат по реакциям 5ы2-типа, что позволяет присоединять молекулы биологически активных
Таблица 7. Сравнение различных матриц для иммобилизации уреазы
и альбумина
Матрица Количество связавшейся уреазы, ед/г Количество связавшегося альбумина, мг/г Замечания
Полиизоцианатактивиро- <7200 105 Независимо от концент-
ванная сферическая рации буфера
целлюлоза
Полиизоцианатактивиро- 3780 40 То же
ванное пористое гид-
роксилированное стекло Полиизоцианатактивиро-
1000 Не опреде- Методика активации и
ванный НА-ультрогель лялось присоединения для
этой матрицы не оп-
180 тимизированы
Эупергит С 0 В 0,1 M фосфатном бу-
16 фере (pH 7,0)
1190 В 0,5 M фосфатном бу-
фере (pH 7,0)
2400 70 В 1 M фосфатном буфе-
ре (pH 7,0)
Таблица 8. Сравнение активностиа ряда ферментов, иммобилизованных на сферической целлюлозе, с активностью выпускаемых фирмами ферментов, иммобилизованных на полиакриламиде и агарозе
Активность в растворе, E Активность Е/г матрицы
Фермент Раствор для присоединения В жидкости после стадии присоединения Целлюлоза Полиакрил-амид (Boeh-ringer En-zygel) Полнакрил-амид (Sigma) Агароза (Sigma)
Уреаза Глюкозооксидаза6 Алкогольдегидро-геназав Трипсин8 9500 6000 7500 4560 2300 2000 Не определялось 370 7200 1100 7000 1950 500 300 Не производится 30 50—60 10—20 50—100 Не производится Не производится 1000—1500 Не производится
?-Галактозидаза11 460 50 240 Не производится
а 1 единица активности (1E) равна количеству фермента, катализирующему реакцию I мкмоль субстрата за 1 мин при 25 0C
°* Присоединена в глициновом буфере (pH 3,0). в Методика присоединения не оптимизирована.
76
Глава 2
веществ с целью их иммобилизации. В принципе любые гидрок-силированные носители могут использоваться в этой реакции. С помощью этого метода могут быть присоединены как амино-, так и тиолсодержащие соединения. Реакционноспособность сульфонатного эфира сильно зависит от заместителя, связанного с сульфонатом. Так, СР3->СР3СН2->я^02-фенил->/г-СН3-фенил- реагируют в соотношении 4000:100:20:1 [10, 11]. Тре-зил (CF3CH2-) и тозил (я-СНз-фенил) удобны как реагенты для иммобилизации ферментов. Первый обеспечивает эффективное нуклеофильное замещение при нейтральных pH и 4 °С. Отщепление тозильных групп можно контролировать по поглощению в УФ-области, причем отщепление протекает легко; однако присоединение должно проводиться при pH 9-ї-10,5. Нерастворимые в воде лиганды могут быть также легко присоединены в органических растворителях (например, в ацетоне). Трезилированные носители во влажном состоянии в 1 мМ HCl можно хранить в течение нескольких недель после активации без изменения их свойств.
10.2. Методика
10.2.1. Активация.
1) Сефарозу CL 6В (25 г влажного геля) промывают суспен-дированием последовательно в воде (75 мл), смесях вода — ацетон (3: 1) (75 мл) и вода — ацетон (1:3) (75 мл) и в заключение в ацетоне (75 мл).
2) К суспензии шариков в ацетоне (10 мл) добавляют то-зилхлорид (7 г), растворенный в ацетоне (10 мл),
