Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
(количество этилендиамина, присоединенного к активированному гелю, определялось с помощью нингидриновой реакции)
Концентрация три-хлоро-сы.и.и-триази-Ч Л g МОЛЬ'Л Количество присоединенного этилендиамина, мкмоль/мг геля
0,3 0,23
0,15 0,17
0,075 0,04
9) Активированный гель промывают 50%-иым (об./об.) ацетоном (5 объемов) и затем водой (5 объемов).
Триазинактивированный гель может храниться в течение нескольких недель в дистиллированной воде при 4 °С без заметной потери активности. Присоединение проводят при умеренно щелочных pH, например в 0,5 M калийфосфатном буфере (pH 7,8).
4.1. Замечания
Степень активации уменьшается при использовании более высокой концентрации NaOH (до 20% (масс/об.)) (табл. 2) или меньшей концентрации трихлоро-силш-триазина (табл. 3).
4.2. Присоединение этилендиамина или алифатического диамина к триазинактивированной агарозе
Готовят суспензию влажного активированного геля (2 г) в воде (2 мл). Добавляют 1 M этилендиамин (4 мл) и осторожно перемешивают не менее 2 ч в течение ночи при комнатной тем-
58
Глава 2
пературе. Степень активации можно определить с помощью нингидринового реагента.
4.3. Триазиновая активация фильтровальной бумаги
1) Фильтровальную бумагу (20X20 см) замачивают в 3,0 M NaOH на 1,5 ч.
2) Осторожно вынимают бумагу и дают стечь избытку NaOH.
3) Бумагу помещают в резервуар, куда добавляют 0,5 M раствор трихлоро-о/лш-триазина в ацетоне (1л).
4) Всю систему оставляют на 1—3 ч, периодически перемешивая. В ходе активации образуется осадок и бумага может деформироваться.
5) Активированную бумагу промывают 50%-ным (об./об.) ацетоном (1 л) в течение 15 мин и затем водой (1 л) также в течение 15 мин.
4.4. Присоединение ж-аминофенилборной кислоты к триазинактивированной бумаге
1) Промытую активированную бумагу помещают в 0,5 M калийфосфатный буфер (pH 7,8), содержащий л-аминофенил-борную кислоту (1 г/л), и оставляют на 24 ч.
2) Для удаления избытка реакционноспособных групп бумагу погружают в 0,5 M этаноламин на 24 ч.
3) Затем бумагу вынимают, промывают 5%-ной (об./об.) уксусной кислотой и 1,0 M KCl и дают высохнуть в течение ночи.
5. АКТИВАЦИЯ АГАРОЗЫ 2,4,6-ТРИФТОРО-5-ХЛОРОПИРИМИДИНОМ
7. Грибнау (Т. С. /. Gribnau) 5.1. Методические указания
Реакции проводят в трехгорлой круглодонной колбе объемом 100 мл с охлаждающей рубашкой (рис. 4). Внутренняя поверхность колбы должна быть предварительно силиконизиро-вана; для этого тщательно вымытую колбу ополаскивают хлороформным раствором специального состава*; после испарения хлороформа колбу нагревают в течение 30 мин при 300 0C Для приготовления суспензии агарозы в реакционной среде используется мешалка Vibro-Mixer (Chemap A. G., Швейцария).
* Торговое название растворенного вещества Dow-Corning 200 Fluid 350 CS; берется 5%-ный (масс/об.) раствор этого вещества в хлороформе.
Методы активации
59
5.Li. Методика Л.
1) Готовят суспензию сефарозы 4В (25 г отфильтрованного геля) в 3,0 NaOH (50 мл); колбу с суспензией медленно вращают в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученную «щелочную сефарозу» отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре; жидкость удаляют путем отсасывания (водоструйный насос).
2) Подготовленный материал суспендируют в 40 мл ксилол-диоксановой смеси (1:1, масс/масс), для чего используют ме-
шалку Vibro-Mixer (при максимальной скорости); суспензию охлаждают до 0 0C
3) Раствор 2,4,6-трифторо-5-хлоропиримидина (ФХП) (4— 5 г, 2,5—3,0 мл) в ксилол-диоксановой смеси (1:1, масс/масс.) (4 мл) добавляют по каплям к приготовленной суспензии, следя за тем, чтобы температура не поднималась выше 0,5 0C; эта операция занимает около 1 ч.
4) Для прекращения реакции добавляют концентрированную уксусную кислоту (4,2 мл).
5) Активированную агарозу отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре и промывают ксилол-диоксановой смесью (200 мл), диоксаном (200 мл) и в заключение водой (1л). Хранят гель при 4 0C
В отличие от исходной сефарозы 4В ФХП-агароза не растворяется в воде при температуре выше 40 °С. Аликвоту геля промывают ацетоном, удаляют жидкость отсасыванием в вакууме водоструйного насоса и сушат в вакууме над концентриро-
с
вибромешалка
охлаждение
Рис. 4. Прибор для ФХП-активации агарозы.
60
Глава 2
ванной серной кислотой. Содержание N, F и Cl определяют элементным анализом. Некоторые аналитические данные представлены в табл. 4.
5.1.2. Методика Б.
1) «Щелочной сефарозой 4В» (~25 г, отфильтрованный гель), полученной по методике А (разд. 5.1.1, п. 1), наполняют пластмассовый шприц (20 мл), игла которого заменена тефлоновой трубкой (длина 7 см, внутренний диаметр 3 мм). Собирают прибор, как показано на рис. 4.
Таблица 4. Типичные результаты нескольких элементных анализов ФХП-активированных агарозных шариков, полученных по методике А
Таблица 5. Типичные результаты нескольких элементных анализов ФХП-активированных агарозных шариков, полученных по методике Б
Партия Содержание, % Партия Содержание. %
N F Cl N F Cl
а 4,6 2,9 5,9 Г 5.8 5,3 6,5
б 4,7 2,8 5,7 Д 5,7 5,4 6,6
