Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
имидокзрбонат и цианатное промежуточное соединение
Рис. 1. Бромоцианактивация полисахаридов.
агароза. Однако для некоторых целей предпочтительнее активировать агарозу в лаборатории непосредственно перед использованием.
1.2. Метод активации с титрованием
Внимание! Всю работу необходимо проводить только в хорошо работающем вытяжном шкафу.
1) В стакан на 100 мл с 20 мл дистиллированной воды добавляют хорошо промытые влажные агарозные шарики (20 г). Температуру реакционной смеси в стакане контролируют термометром (0-^ 100°С), а pH среды — pH-метром; для перемешивания используют магнитную мешалку (причем для предотвращения измельчения и разрушения шариков магнитик магнитной мешалки должен иметь центральный выступ; при отсутствии такого магнитика можно по центру стержня одевать 1-миллиметровую полоску тефлона или полиэтилена).
2) Суспензию медленно перемешивают, при необходимости добавляют измельченный лед (для поддержания температуры 10—150C) и доводят pH до 10,8+0,1 с помощью 4,0 M NaOH (1—2 капли).
4—139
50
Глава 2
3) Процесс активации начинают с действия CNBr при pH 10,8+0.1 (поддерживается добавлением 4,0 NaOH из бюретки). CNBr (100 мг/г влажного геля) может вводиться в измельченном твердом виде, а также в виде раствора в ацетонит-риле (1 г/мл). Такой раствор можно хранить в герметично закрытой склянке, находящейся в вертикальном положении внутри другого контейнера с винтовой пробкой при —2O0C
4) Температуру реакционной смеси повышают до 18—2O0C Окончание реакции соответствует моменту установления постоянного значения pH реакционной смеси, так что добавление щелочи уже не требуется.
5) По окончании стадии активации гель быстро охлаждают путем добавления измельченного льда. (Осторожно! Очень часто для получения промышленного льда используется водопроводная вода. Кроме того, лед может быть загрязнен маслами. Поэтому перед применением необходимо проверить небольшое количество льда и использовать на этой стадии только чистый лед.) Реакционную смесь переносят на большую воронку с пористым стеклянным фильтром, предварительно охлажденную измельченным льдом.
6) Активированный носитель отделяют фильтрованием с помощью колбы Бюхнера (2 л), в которую для удаления не-прореагировавшего CNBr и цианидов в виде нетоксичного фер-роцианида наливают раствор сульфата железа(II) (для разложения CNBr вполне подходит также 3—4 M NaOH; он удобен при активации небольших количеств носителя).
7) Гель промывают (с отсасыванием) ледяной дистиллированной водой (1 л) и буфером (1л), используемым на стадии присоединения.
1.3. Стадия присоединения
Большинство непротонированных первичных аминов (трнс составляет исключение; см. гл. 2, разд. 1.1) эффективно присоединяются к CNBr-активированной агарозе и декстрану с образованием продуктов, структура которых показана на рис. 1. Образование N-замещенных производных изомочевины или нминокарбонатов зависит от используемого носителя. Присоединение должно проводиться при рН>р/Са лиганда (однако рН<10). Так, для ароматических аминов следует использовать pH 7^-8 (р^Са ~ 5), для аминокислот pH 9,5 ч-10 (p/(a Cx-NH2 ~ 8) и для алифатических аминов pH 10 (р/Са~ ~9+10). В реакции присоединения не следует применять буферы, содержащие аминогруппы (при необходимости можно использовать трис [1]), так как аминогруппы буфера конкурируют с аминогруппами лиганда в реакции с активированными группами матрицы. В этих реакциях удобны боратные или
Методы активации
51
карбонатные буферы. Эффективность присоединения снижается при рН>9,5+10,0 (рис. 2), поскольку в этих условиях устойчивость активированного комплекса резко уменьшается. CNBr-активированная сефароза также нестабильна при повышенных температурах, и реакцию присоединения обычно проводят при 4 °С.
14 г
Рис. 2. Влияние pH на присоединение []4С]-аланина к CNBr-активированноА агарозе [2]. (Воспроизведено с разрешения.)
1.4. Другой метод активации [3]
1) Агарозу (10 г) промывают фосфатным буфером (25 мл) и путем фильтрования удаляют основные количества воды.
2) Агарозу переносят в пробирку, содержащую буфер в количестве, указанном в табл. 1.
3) Медленно добавляют бромоциан в указанных количествах и осторожно встряхивают смесь в течение 10 мин при 50C
4) По окончании реакции продукт собирают на пористом стеклянном фильтре и промывают ледяной дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата.
5) К активированной агарозе должен быть немедленно присоединен соответствующий лиганд или вставка.
6) Для присоединения к матрице лигандов или вставок, содержащих свободные первичные аминогруппы, 20 мл CNBr-ак-
4*
52
Глава 2
тивированной агарозы (или то же количество продажной CNBr-активированной агарозы, подготовленной в соответствии с указаниями фирмы-производителя) промывают 0,25 M раствором NaHCO3 (50 мл).
7) К промытой CNBr-активированной агарозе добавляют 0,25 M раствор NaHCO3 (20 мл), содержащий растворенный лиганд или вставку (50—500 мг).
Таблица 1. CNBr-активированная агароза
Степень модификации3 Концентрация агарозы в геле, % (масс/об.) Объем буфера, мл Объем водного раствора CNBr, мл
