Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
2) Зависимость от pH. Присоединение проводится в интервале pH 9-е-13. Использование максимального pH ограничивается стабильностью лиганда и углеводных цепей матрицы. Устойчивость оксирановых групп также зависит от pH.
Методы активации
55
3) Зависимость от температуры. Присоединение проводят в температурном интервале 20—450C (водяная баня) предпочтительно с использованием качалки. Нельзя применять прямое нагревание и магнитные мешалки. При работе при более высоких температурах время реакции может быть сокращено; гели механически устойчивы при высоких температурах, поэтому при проведении элюирования можно использовать температуры вплоть до 100 °С.
4) Время реакции. Время реакции сильно зависит от pH раствора для присоединения, свойств лиганда и температуры проведения реакции присоединения. Эффективность присоединения также зависит от pH и температуры; наиболее часто реакцию присоединения проводят при 20—45 °С в течение 16 ч.
3. N-ГИДРОКСИСУКЦИНИЛАМИДОСУКЦИНИЛ-АГАРОЗА /У. Мацумото (L Maisumoto)
Эпоксиактивированная агароза при обработке растворами аммиака может быть превращена в аминопроизводные, которые с помощью янтарного ангидрида могут быть затем сукцинили-рованы и активированы N-гидроксисукцинимидом.
3.1. Аминирование эпоксиактивированной агарозы до амино-агарозы
1) Эпоксиактивированную агарозу тщательно промывают дистиллированной водой на пористом стеклянном фильтре и суспендируют в концентрированном растворе аммиака (1,5 объема).
2) Суспензию выдерживают при 4O0C в течение 1,5 ч при встряхивании, затем переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают гель дистиллированной водой.
3.2. Получение N-гидроксисукцинимидного эфира агарозы
1) Амино-агарозу промывают 0,1 M NaCl и суспендируют в 0,1 M NaCl (1,5 объема).
2) Постепенно небольшими порциями добавляют измельченный янтарный ангидрид (0,08 г/г влажной амино-агарозы).
3) Добавлением 20% (масс/об.) NaOH поддерживают в суспензии pH 6.
4) После установления постоянного значения pH (без дополнительного добавления NaOH) суспензию выдерживают в течение 5 ч.
5) Для удаления лабильных карбоксильных групп промытую сукцинилированную агарозу инкубируют с ОД M NaOH в течение 30 мин при комнатной температуре.
56
Глава 2
3.3. Активация сукциниламино-агарозы N-гидроксисукцинимидом
1) Сукциниламино-агарозу промывают большим количеством диоксана до обезвоживания и готовят суспензию в диокса-не (3 объема).
2) К суспензии при постоянном перемешивании добавляют твердый гидроксисукцинимид и дициклогексилкарбодиимид до конечной концентрации 0,1 моль/л по каждому реагенту.
3) Реакционную смесь оставляют на 70 мин, затем гель промывают диоксаном (8 объемов), метанолом (4 объема) (для удаления осадка дициклогексилмочевины) и диоксаном (3 объема).
3.4. Присоединение гемагглютинина из Lens culinaris к активированной агарозе
1) Влажную активированную сефарозу 4В (20 г) на пористом стеклянном фильтре быстро промывают водой (50 мл) и затем немедленно переносят в стакан, в котором находится лектин (100 мг), растворенный в смеси состава 0,9% NaCl + +0,01 M NaHCO3 (pH 7,5; 100 мл)+0,1 M метил-а-0-маннозид.
2) Суспензию оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4 °С.
3) Для блокирования оставшихся реакционноспособных групп гель инкубируют с 0,1 M триэтаноламин-НС1-буфером (pH 9,0) в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. ТРИАЗИНОВАЯ АКТИВАЦИЯ АГАРОЗЫ К. Лонгстаф (С. Longstaff)
1) Поперечно-сшитую агарозу (1 объем) промывают на пористом стеклянном фильтре дистиллированной водой (5 объемов) и затем 12%-ным (масс/об.) раствором NaOH (5 объемов).
2) После стекания NaOH под действием силы тяжести гель переносят в 12%-ный (масс/об.) раствор NaOH (1 объем).
3) Суспензию охлаждают в бане (лед+соль) до +50C (=Ы°С).
4) Готовят 0,5 M раствор трихлоро-силш-триазина (для удаления циануровой кислоты перекристаллизованного один раз из кипящего хлороформа) в ацетоне; раствор охлаждают до —50C (лед+соль).
5) Приготовленный раствор (2 объема) осторожно приливают к суспензии геля (1 объем) таким образом, чтобы образовалось два слоя.
Методы активации
57
6) При охлаждении реакционной смеси льдом с солью начинают медленное перемешивание на магнитной мешалке (магнитик должен иметь по центру выступ). Слои постепенно смешиваются, перемешивание продолжают еще 100 мин до полного исчезновения расслаивания.
7) В течение всего периода перемешивания надо контролировать температуру внутри реакционной смеси и охлаждать реакционную колбу льдом.
8) После установления требуемой температуры лед можно убрать и продолжать перемешивание при комнатной температуре.
Таблица 2. Влияние концентрации NaOH на триазиновую активацию
(количество гександиамина, присоединенного к активированному гелю, определялось с помощью нингидриновой реакции)
Концентрация NaOH, % (масс/об.) Время, мин Количество присоединенного гександиамина, мкмоль/мг геля
10 90 0,92
15 130 0,68
17 130 0,64
20 120 0,46
Таблица 3. Влияние концентрации трихлоро-сижлі-триазина па триазиновую активацию агарозы
