Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
5) После гидролиза в каждый образец добавляют ледяную уксусную кислоту (0,22 мл); из каждой пробирки берут алик-воту (1 мл) и прибавляют свежеприготовленный нингидриновый реагент (1 мл). Для приготовления нингидринового реагента растворяют нингидрин (2 г) и гидриндантоин (0,15 г) в метил-целлозольве (75 мл) и добавляют 4,0 M натрийацетатный буфер (pH 5,5; 25 мл) [8, 9].
6) Все образцы разбавляют этанолом (2 мл) для получения прозрачного раствора и измеряют оптическую плотность при 570 нм.
8.4.5. Пример А. Сефароза CL 6 В с иммобилизованными антителами барана против человеческого Fe. Активированный гель (13 г) прибавляют к раствору антител барана против человеческого Fc (10 мл), содержащему 10,7 мг белка/мл. Реакцию продолжают в течение 48 ч при 2—80C Полученный гель содержит 4,2 мг белка на 1 г влажного геля.
8.4.6. Пример Б. Сефароза CL 6В с иммобилизованным F(abf)i человека. Активированный гель (12 г) прибавляют к полученному обработкой пепсином фрагменту F(ab') 2 IgG человека (10 мл), содержащему 5,4 мг белка/мл. Реакцию продолжают в течение 48 ч при 2—8 °С. Полученный гель содержит 4,2 мг белка на 1 г влажного геля.
8.4.7. Пример В. Сефароза CL 6В с иммобилизованным IgG человека.
1) Активированный гель (57 г) промывают буфером для присоединения с высокой ионной силой (0,1 M фосфат, содержащий 1,0 M NaCl и 0,01 M карбонат; pH 9,5).
2) Добавляют раствор IgG человека (50 мл), содержащий 10 мг белка/мл в том же буфере (фракция II IgG человека, фирма Fluca AG, Швейцария).
3) Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 16 ч.
Методы активации
71
4) Гель обрабатывают, как описано выше. Полученный гель содержит 5,5 мг белка на 1 г влажного геля.
8.4.8. Пример Г. Сефароза CL 6В с иммобилизованным человеческим альбумином. Активированный гель (19,5 г) прибавляют к 15 мл раствора человеческого альбумина (15 мг/мл) в 0,01 M карбонате натрия (pH 9,5); pH доводят с помощью NaOH. Реакцию проводят в течение 48 ч при 2—8 °С и обрабатывают, как описано выше. Полученный гель содержит 12,5 мг белка на. 1 г влажного геля.
9. ПОЛИИЗОЦИАНАТНАЯ АКТИВАЦИЯ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИМЕРОВ
Г. Кризам (G. Krisam)
9.1. Некоторые сведения об используемых матрицах
9.1.1, Сферическая целлюлоза. Целлюлоза в форме сферических гранул (Институт макромолекулярной химии, Прага, ЧССР) может быть получена в следующих интервалах по размеру: 20—60, 40—100, 100—200, 200—500 и 500—2000 мкм. Благодаря наличию высокоструктурированных участков обеспечивается высокая механическая прочность матрицы даже в отсутствие поперечной сшивки. Пористость составляет 80—90% с размерами пор 10—60 нм, 10—20% пор имеют размер больше, чем 60 нм. Процесс получения достаточно прост и включает стадии, представленные на рис 5.
9.1.2. Полигидроксимодифицированное стекло с контролируемым размером nop (Serva, ФРГ). Стекло с контролируемым размером пор представляет собой сферические частицы с диаметром 100—200 мкм. Размеры пор 40—80 нм. Благодаря по-лигидрокси-покрытию носитель является гидрофильным и электронейтральным. Кислотные группы стекла блокированы, и неспецифическое взаимодействие с белками весьма незначительно.
9.2. Методика активации на примере сферической целлюлозы
1) Для дегидратации шариков целлюлозы (предпочтительно диаметром 200—500 мкм) их обрабатывают органическим растворителем (например, ацетоном или метанолом).
2) Добавляют катализатор.
3) Растворитель удаляют и шарики обрабатывают полиизо-цианатом.
72
Глава 2
4) Шарики промывают органическим растворителем, сушат в вакууме и хранят в запаянных стеклянных ампулах.
Активированные шарики целлюлозы чрезвычайно устойчивы. Продукт может храниться в течение 3 недель в открытом стеклянном сосуде без заметной потери связывающей емкости.
Целлюлоза
• растворитель
солюбилизированнзя целлюлоза
1) приготовление эмульсии
2) нагревание
сферическая целлюлоза
промывание
продукт
Сферическая целлюлоза
О промывание
2)обезвоживание органическими растворителями
обезвоженная
сферическая
целлюлоза
11 катализатор 21полиизоцианат
активированная
сферическая
целлюлоза
\) промывание 2)выс/шивание
продукт
Рис. 5. Получение сферической целлюлозы.
Рис. 6. Получение полиизоцианатак-тивированной сферической целлюло-
Если продукт хранится в стеклянных банках с завинчивающейся пробкой, то связывающая емкость не уменьшается в течение более одного года. Процесс активации представлен на рис. 6.
9.3. Методика присоединения
Присоединение белков и лигандов к активированной матрице осуществляется довольно просто (рис. 7).
Сухую предварительно активированную матрицу промывают 0,1 M HCl. затем переносят ее в раствор белка в соответствующем буфере. Изоцианатные группы реагируют с аминогруппами белка. Реакционную смесь перемешивают в течение 2— 3 ч при комнатной температуре, затем продукт промывают. В случае альбумина реакция завершается за 3 ч (рис. 8).
Методы активации
73
9.4. Сравнение с другими методами присоединения
Благодаря полимерным вставкам и мягким условиям реакции при использовании полиизоцианатной активации достигаются высокие выходы и незначительная потеря ферментативной активности. Иммобилизованная уреаза сохраняет высокую активность; степень присоединения прямо пропорциональна кон-
