Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
ЭДАК
km-агароза
АЭКМ-агароза
(2)
Методы активации
79
11.2. Методика
//.2.7. Материалы и растворы. В приведенных ниже методиках используют сферическую поперечно-сшитую агарозу, производимую фирмой Pharmacia Fine Chemicals (сефароза CL4B), Хлороуксусную кислоту (фирма Sigma Chemical Со или Fisher Scientific Со.) необходимо оттитровать для определения содержания основного вещества (титра), поскольку продажные препараты сддержат небольшое, но различное количество воды.
1) Навеску хлороуксусной кислоты (~0,8 г) растворяют в 50 мл воды.
2) Добавляют несколько капель раствора индикатора бро-мотимолового голубого [0,1 %-ный (масс/об.) раствор в 50%-ном (об./об.) этаноле] и титруют 1,0 или 2,0 M NaOH.
3) Рассчитывают эквивалентный вес как вес образца кислоты в милиграммах, разделенный на милиэквиваленты использованного NaOH. 6,0 M NaOH получают разбавлением 10,0 M раствора, поставляемого фирмой Fisher Scientific Co.
1,5 M (20%, масс/об.) раствор дихлорогидрата этилендиами-на (CH2)2(,NH2)2-2HC1 (pH 4,6) готовят по следующей методике.
1) Дихлорогидрат этилендиамина (300 г) (Sigma или Eastman) растворяют в 1,2 л дистиллированной воды и доводят объем до 1,5 л водой.
2) Раствор перемешивают с 15 г активированного угля (например, Darco G-60) в течение 30 мин.
3) Фильтруют через складчатый фильтр (бумага Whatman № 1).
4) Доводят pH до 4,6 путем добавления 5,0 M NaOH. Неиспользованный раствор можно хранить в темной стеклянной бутылке в течение многих месяцев.
Хлорогидрат 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДАК) поставляется фирмой Sigma. N-гидроксисукцинимид-ный эфир 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты [также называемый N-сукцинимидил-З- (2-пиридилдитио) пропионат; СПТП] выпускается фирмами Sigma или Pharmacia.
Используется ГЭПЭК-ЭДТА-буфер (pH 7,6) состава: 0,15 M ^2-гидроксизтилпиперазин-ій'-2-зтансульфоновая кислота+ +0,079 M NaOH+1,0 мМ ди- или тринатриевая соль этилен-диаминтетраацетата.
Используется еще один буфер, приготовляемый из 3 объемов ГЭПЭК-ЭДТА-буфера с pH 7,6 (вышеописанного состава) и 2 объемов ^^диметилформамида (марки Spectro).
11.2.2. Получение шариков карбоксиметилированной (КМ)-агарозы. Стеклянную посуду надо силиконизировать для уменьшения прилипания агарозных шариков. Щелочная суспензия (см.
80 Глава 2
-_^-
ниже) перед добавлением хлороу^еусной кислоты охлаждается; до 150C для компенсации теплд, выделяемого при нейтрализа^ зации, и обеспечения требуемой температуры ¦250C Для сус-пендирования следует прийнять мешалку с мотором, поскольку перемешивание на магнитной мешалке разрушает шарики. Быстрое первое промывание приводит к окончанию реакции. Если для переноса на воронку и отмывку основной части реагентов требуется 7 мин, то общее время реакции при 25 °С составляет 75 мин (68+7). При проведении описанных ниже экспериментов следует применять меры предосторожности при работе с хлороуксусной кислотой и каустической смесью. Для предотвращения попадания реактивов на кожу или в глаза необходимо работать в защитных перчатках и очках. Методика включает следующие стадии.
* 1) В большой стакан помещают суспензию агарозных шариков в количестве, соответствующем ~400 мл упакованного объема.
2) Шарики суспендируют в 0,1 M NaCl (2,4 л). Суспензию перемешивают в течение 5 мин, а затем позволяют шарикам осаждаться в течение 60—90 мин. Жидкость над осевшими шариками отбирают до общего объема в стакане 600 мл и отбрасывают ее вместе с мелкими частицами.
3) Повторяют операцию (п. 2) еще три раза.
4) Осевшие шарики переносят в стакан меньшего объема и доводят объем до 600 мл с помощью 0,1 M NaCl.
5) Добавляют 600 мл 6,0 M NaOH и перемешивают смесь на ледяной бане до охлаждения до температуры 15¦0C
6) Ледяную баню убирают и добавляют 1,20 моль (на основании результатов титрования; см. выше) хлороуксусной кислоты.
7) Доводят температуру до 25,0+0,2 °С и продолжают перемешивание при этой температуре в течение 68 мин.
8) Немедленно переносят суспензию на фарфоровую воронку Бюхнера (№ 4A), покрытую влажной фильтровальной бумагой (Whatman № 1), применяя отсасывание. Быстро промывают гель 2,5 л 0,1 M NaCl.
9) Далее гель на воронке медленно промывают 10 л 0,1 M NaCl без отсасывания (раствор стекает под действием силы тяжести), увеличивая промежутки времени между последовательными порциями.
Полученную КМ-агарозу можно либо хранить при 4 0C в. 0,1 M NaCl, содержащей 0,04% (масс./об.) азида натрия в качестве консерванта, либо оставить на фильтре для немедленного получения АЭКМ-агарозы.
11.2.3. Получение шариков аминоэтилкарбамилметил(АЭКМ)-агарозы. В качестве исходного материала используют КМ-про*
Методы активации
81
изводное, полученное в разд> 11.2.2 (~370 мл упакованного объема).
1) Гель промывают четырьмя порциями по 150 мл 1,5 M дихлорогидрата этилендиамина (разд. 11.2.1). После прохож-дения через гель каждой порции применяют краткое отсасывание.
2) Влажный гель переносят в стакан объемом 1 л. Суспендируют шарики в 1,5 M дихлорогидрате этилендиамина (в 650 мл).
3) Доводят pH до 4,6 (используя 2,0 M HCl или NaOH) > добавляют порциями 5,85 г ЭДАК при перемешивании за 30 мин при комнатной температуре; перемешивание продолжают еще 30 мин. Поддерживают в ходе этой и следующей стадий pH 4,6-5-4,8 (2,0 M HCl или NaOH).
