Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
8) Полученное л-диазопроизводное промывают холодной дистиллированной водой (250 мл), 1%-ной (масс/об.) сульфамино-вой кислотой (50мл) и дистиллированной водой (250мл), а затем в течение ночи перемешивают при 40C с 0,1 M NAD в 0,2 M боратном буфере (pH 8,3).
9) Производное бензамидогексил-сефарозы с иммобилизованным NAD отделяют путем фильтрования и тщательно промывают.
8.2. Получение диазоний-агарозы
1) Готовят, как описано в гл. 2 (разд. 1), ледяную промытую CNBr-активированную сефарозу (50 мл).
2) Воду удаляют путем отсасывания на пористом стеклянном фильтре.
3) Гель перемешивают в течение ночи при 4 °С в 1,0 M бенз-амидине (100 мл), предварительно доведенном до pH 10,0 с помощью HCl.
4) Бензамидин-агарозу тщательно промывают дистиллированной водой и проводят реакцию диазотирования. Для этого перемешивают в течение 10 мин с 2,5 объемами охлажденного 0,1 M NaNO5 в 0,5 M HCl.
5) л-Диазопроизводное промывают охлажденной дистиллированной водой (250 мл), 1%-ной (масс/об.) сульфаминовой кислотой (50 мл) и вновь дистиллированной водой (250 мл), а затем обрабатывают в течение ночи при 40C соответствующим лигандом в 0,2 M боратном буфере (pH 8,3).
6) Агарозу отделяют путем фильтрования и тщательно промывают.
Внимание! Бензамидин высокотоксичен.
Подобная методика может быть проведена с использованием ж-аминонитробензола. При этом лиганд иммобилизуется через аминогруппу, последующее восстановление нитрогруппы дитионитом и диазотирование проводят, как описано выше.
92
Глава З
9. ПРИСОЕДИНЕНИЕ ЛИГАНДОВ ЧЕРЕЗ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ АЗОКРАСИТЕЛИ Т. Грибнау (Т. С. /. Gribnau)
9.1. Получение регенерированной целлюлозы
1) Готовят раствор хлопка-сырца (3,3 г) под азотом в 1 л раствора гидрооксида тетрамминмеди [12 г Cu(OH)2 и 2 г CuCl в 1 л 25%-ного (насыщенного) водного аммиака].
2) Темно-синий вязкий раствор фильтруют через стекловату под давлением азота и затем вводят при постоянном перемешивании в 5%-ный (масс/об.) водный калий-натрий тартрат (1л); поддерживают нейтральный pH постоянным добавлением уксусной кислоты.
3) Выпавшую в осадок целлюлозу собирают и тщательно промывают 5%-ной (об./об.) уксусной кислотой и водой. Продукт можно хранить в 0,1% (масс/об.) водном NaN3 при 4 °С.
9.2. Определение содержания целлюлозы в суспензии регенерированной целлюлозы
1) Продукт, полученный по методике, описанной в разд. 9.U помещают в стакан и прибавляют 0,1%-ный (масс/об.) водный раствор NaN3 до содержания целлюлозы ~20 мг/мл. Эффективно перемешивают до получения гомогенной суспензии и немедленно отбирают 1 мл в предварительно взвешенную коническую центрифужную пробирку (например, Eppendorf Reak-tionsgefass, 1,5 мл, тип 3810).
2) Пробу центрифугируют при 12 000 g (~ 15 ООО об./мин) в течение 3 мин; супернатант сливают (или осторожно отбирают с помощью пипетки) и добавляют 1 мл дистиллированной воды.
3) Целлюлозу вновь суспендируют и центрифугируют.
4) Повторяют эту стадию три раза с использованием дистиллированной воды и затем три раза с ацетоном (продажной степени чистоты).
5) Избыток ацетона, удерживаемый твердым остатком, удаляют путем нагревания прямо в центрифужной пробирке (^560C) в течение ~15 мин.
6) Остаток в пробирке сушат в вакууме над концентрированной серной кислотой при комнатной температуре в течение ночи.
7) Пробирку с содержимым выдерживают при комнатной температуре и нормальной влажности в течение 2 ч перед окончательным взвешиванием.
Препарат регенерированной по описанной в разд. 9.1 методике целлюлозы должен содержать в суспензии ~20 мг/мл целлюлозы. Хранят суспензию при 4 °С.
Поперечно-сшивающие агенты
93
9.3. Присоединение реакционноспособного азокрасителя к регенерированной целлюлозе и восстановление
до аминоарил-целлюлозы
1) Суспензию целлюлозы (разд. 9.2) тщательно перемешивают и отбирают объем, содержащий ~1 г целлюлозы (50 мл).
2) Целлюлозу отделяют путем фильтрования (пористый стеклянный фильтр; например, Schott & Gen, Mainz, 3D-3) или центрифугирования (— 1000 g) и тщательно промывают дистиллированной водой (3 раза по 50 мл).
3) Целлюлозу вновь суспендируют в дистиллированной воде (5—10 мл) и нагревают до 40—45 °С.
4) К суспензии прибавляют левафикс бриллиантовый красный Е-4ВА (фирма Bayer; 25 мг), растворенный в дистиллированной воде (10 мл).
5) Смесь перемешивают в течение 5 мин (40—45°С), добавляют NaCl (2,5 г), растворенный в дистиллированной воде (10 мл), и перемешивают еще в течение 30 мин (40—45°С).
6) Прибавляют твердый безводный Na2CO3 (0,5 г) и перемешивают еще 90 мин (40—450C).
7) Окрашенную целлюлозу отмывают от несвязавшегося красителя дистиллированной водой на пористом стеклянном фильтре или центрифугированием (~1000 g).
8) Окрашенную целлюлозу вновь суспендируют в дистиллированной воде (10 мл) и нагревают до 65—7O0C
9) Прибавляют твердый дитионат натрия (Na^O^ 0,5ч-Ir)^ что приводит к быстрому обесцвечиванию целлюлозы (Внимание! Реакцию надо проводить в хорошо работающем вытяжном шкафу); жидкая фаза остается желтой.
10) Аминоарил-целлюлозу отделяют путем фильтрования или центрифугирования и тщательно промывают дистиллированной водой.
