Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
азокраситель
Cl
N
'Na7SA
NaNO2 / HCl
23"OH - полисахарид L -лиганд
Ar-арильный остаток
Й-Аг^МуО-И N
O-0
НО L
Н0\__
0-0
Рис. 1. Присоединение ГХЧ к сефарозе CL 4В с использованием активации реакционноспособными азокрасителями.
9.5.2. Восстановление производного краситель-сефароза до ами-ноарил-сефарозы.
1) Продукт, полученный по методике, описанной в разд. 9.5.1, суспендируют в дистиллированной воде (30 мл) и суспензию нагревают до 60 °С.
2) Прибавляют твердый дитионит натрия (Na2S204; 1,25г), что приводит к немедленному обесцвечиванию сефарозы; жидкая фаза остается желтой.
3) Сефарозу отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой (8 раз по 50 мл).
9.5.3. Диазотирование аминоарил-сефарозы; присоединение го-надотропина хориона человека (ГХЧ).
1) Продукт, полученный по методике, описанной в разд. 9.5.2, суспендируют в 0,1 M HCl (45 мл) и прибавляют 1,0 M NaNO2 (9 мл).
2) Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при 4 0C
3) Диазотированную аминоарил-сефарозу отфильтровывают, тщательно промывают дистиллированной водой (4 °С) до pH
Поперечно-сшивающие агенты
97
фильтрата 6ч-7 и затем промывают боратным буфером (pH 8,6; 4°С; 3 раза по 50 мл).
4) Влажный диазотированный носитель (20 г) суспендируют в боратном буфере (pH 8,6; 4°С; 15 мл); прибавляют раствор ГХЧ в боратном буфере (pH 8,6; 10 мл; 1 мг/мл) и проводят реакцию присоединения в течение 16 ч при 4 °С (рекомендуется перемешивание на роллерной мешалке).
5) Продукт отфильтровывают, промывают боратным буфером (pH 8,6; 4 раза по 50 мл; фильтраты — А), раствором ?-нафтола в боратном буфере (pH 8,6; 0/75 г/л; 3 раза по 50 мл), боратным буфером (pH 8,6; 5 раз по 50 мл) и в заключение боратным буфером (pH 7,0), содержащим NaN3 (1 г/л).
Составы боратных буферов pH Содержание, г/л
Na2B4O7^ 10H8O H3BO3 NaCl
7 1,43 11,47 —
8,6 10,49 5,57 2,93
Используют свежеприготовленный раствор ?-нафтола; для этого ?-нафтол (0,75 г) прибавляют к боратному буферу (pH 8,6; 1 л), перемешивают раствор в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте и фильтруют.
6) Хранят ГХЧ-сефарозу при 40C в виде суспензии в указанном боратном буфере.
Буферы для присоединения не должны содержать азид натрия, так как N3~-rpynnbr замещают N2+CI--FPyHnH, препятствуя таким образом присоединению белка (лиганда). Содержание ГХЧ в объединенных фильтратах А определяется иммунофер-ментным методом, что позволяет установить содержание ГХЧ на аффинном сорбенте; обработка производного сефарозы ?-нафто-лом приводит к немедленному появлению красно-оранжевой окраски.
10. ПОЛУЧЕНИЕ ТИОЛ-АГАРОЗ
10.1. Активированная глутатион-агароза
1) Проводят активацию 50 г агарозы бромоцианом (гл. 2, разд. 1, или любым другим методом, описанным также в гл. 2).
2) Активированную агарозу промывают 0,1 M NaHCO3 (pH 8,5; 10 объемов), затем смешивают с равным объемом того же буфера, содержащего 20 мг глутатиона/г агарозы.
3) Смесь встряхивают в течение 20 ч при 22 °С.
4) Гель промывают 0,1 M NaHCO3 (pH 9,5; 10 объемов) на пористом стеклянном фильтре. Переносят в колонку (1,8Х
7—139
98
Глава З
ХЗО см, ~50 мл) и последовательно промывают (порциями по 240 мл) следующими растворами:
0,1 M NaHCO3, (pH 9,5), содержащим 1,0 моль/л NaCl и 1 ммоль/л ЭДТА;
0,1 M ацетатом натрия (pH 4,3). содержащим NaCl и ЭДТА в тех же концентрациях;
1 мМ ЭДТА,
При пропускании через колонку каждого раствора рекомендуется скорость потока 10 мл/ч.
5) Влажный гель (50 г) переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают 0,1 M трис-HCl (pH 8,0; 450 мл), содержащим 0,3 ммоль/л NaCl и 1 ммоль/л ЭДТА.
6) Остаток жидкости удаляют и промытый гель суспендируют в том же буфере (60 мл), содержащем 30 ммоль/л дитио-треитола (ДТТ); смесь оставляют на 10 мин для восстановления всех доступных сульфгидрильных остатков.
7) Гель промывают следующими растворами (по 150 мл каждого): 1 M NaCl, 0,5M NaHCO3, 0,3 M NaCl, 0,1 M трис-HCl (pH 9,0) и 0,3 M NaCl; каждый раствор содержит 1 ммоль/л ЭДТА.
8) Для активации восстановленный и промытый гель оставляют при осторожном встряхивании в течение 30 мин с 1,5 мМ 2,2'-дипиридилдисульфидом при комнатной температуре.
9) Активированную глутатион-2-пиридилдисульфид-агарозу промывают для удаления избытка 2,2'-дипиридилдисульфида> как описано в п. 7.
10) Заключительную промывку 0,1 M трис-HCl и 0,3 M NaCl (pH 8,0), содержащим 1 ммоль/л ЭДТА, следует контролировать путем измерения поглощения при 280 нм.
11) Промывание продолжают до отсутствия поглощения при 280 нм в промывных водах.
10.2. Получение тиопропил-агарозы
1) Шарики 6%-ной агарозы (30 г) промывают водой и отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре с отсасыванием.
2) Шарики суспендируют в 1,0 M NaOH (24 мл). К суспензии при перемешивании прибавляют эпихлорогидрин (0,75 мл) при комнатной температуре. Это должно привести к конечному содержанию тиольных групп 50 мкмоль/г сухой агарозы.
3) Перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин, затем повышают температуру до 60 0C и продолжают перемешивание еще в течение 2 ч.
