Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
по
Глава 4
нуклеотидов, возможно, отражают влияние адсорбента на взаимодействие, так как при неполном взаимодействии NAD с 6-ами-ногексаноил-сефарозой на матрице могут оставаться заряженные группы.
Процент связывания глицерокиназы с N6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозой уменьшается при значениях рН>7,0; кажущаяся константа р/С~8. Кроме того, прочность связывания-фермента с иммобилизованным лигандом совпадает с соответствующей pH-зависимостью. Уменьшение связывания при изменении pH наблюдалось при взаимодействии лактатдегидрогена-зы с 6-аминогексаноил-КАО-сефарозой. В идентичных условиях в исследованной области pH бычий сывороточный альбумин не проявлял сродства к этому адсорбенту.
Известно несколько примеров хроматографии на иммобилизованных красителях, когда увеличение pH элюирующего буфера ослабляет связывание белков с адсорбентом. Так, иммобилизованный цибакрон голубой 3G-A при более высоких pH связывает белки плазмы крови менее жестко [12]. При pH 5,0 95% белков связывается на колонке, в то время как при pH 9,0 связывается только 40% белков (главным образом альбумин). Значения pH, при которых различные белки плазмы выходят с колонки, не коррелируют с изоэлектрическими точками белков,, указывая, что для процесса элюирования важны специфические участки поверхности, а не суммарный заряд белка. Однако отсутствие подобных корреляций наблюдается не всегда; так,, связывание 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из Bacillus stearo-thermophilus с сефарозой с иммобилизованным цибакроном голубым уменьшается при рН<6,5 или увеличивается при рН> >8,5 [13].
С уменьшением pH могут происходить изменения в механизме связывания. Так, при использовании колонок с иммобилизованным фенилборонатом при рН<8,0 возникают затруднения по количественному разделению HbAiC и HbA, поскольку при этом pH имеет место гидрофобное взаимодействие, вызывающее неспецифическое связывание с колонкой HbA [14].
Для оптимизации разделений, основанных на биоспецифическом сродстве, важно изучить pH-зависимость связывания индивидуальных белков на колонке в максимально возможном интервале pH.
6,2. Влияние температуры
Температура оказывает заметное влияние на емкость аффинных колонок. При повышенных температурах уменьшается степень удерживания дрожжевой алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы на N6- (6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозе. Однако глицерокиназа может количественно связываться при этих по-
Методики эксперимента
111
т
I_І_I-L-
О IO 20 ЗО
Температура,°С
Рис. 7. Влияние температуры на связывание дрожжевой алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы с Ne-(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозой. Концентрация AMP (мкмоль/л): / и 2—1,5; 5 — 4,0 [11]. (Воспроизведено с разрешения.)
вышенных температурах при увеличении концентрации иммобилизованного лиганда до 4 мкмоль 5'-АМР/мл сефарозы. На рис. 7 показано, что при обеих концентрациях лиганда прочность связывания (оцениваемая концентрацией соли, соответствующей пику элюирования фермента) между иммобилизованным лигандом и ферментами уменьшается при повышенных температурах.
Лактатдегидрогеназа настолько прочно связывается с N6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозой, что не может быть элюирова-на 1,0 M KCl при 4O0C Однако элюирование можно осущест-
I_і_і-1_і_і і
0 5 10 15 20 25 30 Температура, °С
Рис. 8. Влияние температуры на связывание лактатдегидрогеназы с N8-(6-аминогексил) -5'-АМР-сефарозой [11]. (Воспроизведено с разрешения.)
112
Глава 4
вить при использовании линейного градиента NADri. Из рис. 8 видно, что концентрация NADH, требуемая для элюирования фермента, также уменьшается с повышением температуры. При повышенных температурах сродство фермента к иммобилизованному лиганду, как правило, уменьшается.
7. ИОННАЯ СИЛА
Электростатические взаимодействия играют важную роль в связывании ферментов на аффинных колонках, поскольку увеличение ионной силы (увеличение концентрации соли в элюи-рующем буфере) обычно приводит к десорбции связанных ферментов с аффинных адсорбентов различных типов. Однако для некоторых ферментов в присутствии соли увеличивается прочность связывания, например, в результате гидрофобных взаимодействий, обусловливающих сорбцию интерферона фибро-бластов [15], интерферона кролика [16] и изоцитратдегидроге-назы из сердца человека [17] на иммобилизованном цибакроне голубом 3-GA. В таких случаях при увеличении ионной силы элюента белки не элюируются с колонки и для их десорбции необходимо применение таких элюентов, как 50%-ный (об./об.) этиленгликоль.
Таблица 1. Влияние ионной силы трех буферов на связывание глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы с гелем матрекс оранжевый B[18]. (Воспроизведено с разрешения.)
Трис-нс1-буфер Триэтаноламнн-ЫаОН-бу-фер Фосфатный буфер
Ионная
сила, ымоль/л
Электро- Степень Электропро- Степень свя- Электропро- Степень свя-
проводность, мСм связывания, % водность, мСм зывания, % водность, мСм зывания, %
10 0,6 0 0,75 9 1,46 89
20 0,87 53 1,38 100 2,55 100
30 1,28 89 2,00 100 3,65 100
40 1,60 100 2,65 100 4,60 100
50 1,95 100 3,25 100 6,00 100
