Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Предварительные результаты показывают, что этот метод может быть применен к эупергиту с иммобилизованными лигандами типа бутиламина.
1.6. Радиоактивные методы
Один из наиболее чувствительных методов определения концентрации иммобилизованных лигандов заключается во введении на стадии присоединения радиоактивно меченного лиганда. Концентрацию иммобилизованного лиганда можно определить дифференциальным анализом, а также путем отщепления (гидролиза) лиганда или непосредственными исследованиями геля. Например, аликвоты геля, содержащего [32P]-GTP, суспендируют в растворе Брея и определяют радиоактивность непосредственно с помощью сцинтилляционного счетчика [2]. Такой же подход используется при прямом определении 1311-меченых белков.
102
Глава 4
1.7. Определение аминов с использованием 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС)
1.7.U Материалы. Кристаллическая ТНБС (фирма Eastman) л лиофилизованные препараты бычьего сывороточного альбумина (фирма Sigma) используются без дальнейшей очистки. Все •аминокислоты, амины и соли имели продажную степень чистоты. Используют растворы аминосоединений в 0,1 M тетра-борате натрия (pH 9,3).
1.7.2. Методика.
1) 0,03 M ТНБС (25 мкм) прибавляют в кювету с образцом (1 мл), смесь тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре (250C).
2) В контрольном опыте готовят смесь, состоящую из 0,03 M ТНБС в 0,1 M борате (1 мл).
3) Определяют поглощение при 420 нм.
1.8. Определение алкиламиногрупп, присоединенных к CNBr-активированной агарозе
Для определения нуклеофильности различных соединений обычно используются л-нитрофениловые эфиры. Так, 1,6-диами-ногексан вызывает отщепление двух эквивалентов л-нитрофе-нолята от л-нитрофенилового эфира. При концентрациях 1,6-ди-аминогексана меньших, чем концентрации эфира, до отношения эфир ч-диамин = 2, скорость отщепления п-нитрофенолята от эфира подчиняется кинетике псевдопервого порядка по диамину. После того как прореагировал весь диамин, можно установить его концентрацию экстраполяцией скорости спонтанного гидролиза к начальному моменту времени. Эта методика определения концентрации амина может быть также применена к диамину, иммобилизованному на сефарозе.
1.8.1. Методика.
1) Образец геля с иммобилизованным диамином (50— 200 мг) промывают 0,25 M боратным буфером (pH 8,5) и переносят в микропробирку Эппендорфа (объем 1 мл), в которой находится маленький магнитик для перемешивания на магнитной мешалке.
2) Тем же буфером доводят объем до 0,22 мл и добавляют 0,1 M n-ндтрофенилацетат в ацетонитриле (0,2 мл) (начало отсчета времени).
3) Суспензию перемешивают при комнатной температуре, отбирая пробы (аликвоты) по 10 мкл приблизительно через каждые 10 мин в течение 2 ч.
4) Пробы разбавляют ледяным 0,05 M боратным буфером (pH 8,75; 5 мл) и быстро измеряют поглощение при 400 нм.
Методики эксперимента
103
5) К оставшейся суспензии добавляют 2,5 M NaOH (5 мкл), отбирают последнюю пробу и после соответствующей подготовки (пункт 4) также измеряют оптическую плотность при 400 нм.
Поглощение, измеренное для последней пробы, дает содержание аминогрупп в образце. Проводят контрольные опыты с используемым буфером и необработанной агарозой.
2. ОТЩЕПЛЕНИЕ ЛИГАНДА
Для систем с высоким сродством (например, в которых осуществляется взаимодействие гормон — рецептор) существует серьезное ограничение в применении аффинной хроматографии.
Выделение пикомолярных и наномолярных количеств белков осложняется относительно легким отщеплением аффинных лигандов в раствор. Эти проблемы исторически возникли в первую очередь ввиду того, что аффинные лиганды связывались моновалентно через вставку с бромцианактивированной агарозой в присутствии соединений (например, буферов и белков), содержащих нуклеофилы.
Для более подробного изучения отщепления аффинных лигандов от специфических адсорбентов Тессер и др. [3] получили адсорбенты присоединением аденозин-3',5'-цикломонофос-фата и других веществ через различные вставки к агарозе, целлюлозе и поперечно-сшитому декстрану посредством бромоци-ан-активации и к полиакриламиду через амидную связь, образованную карбоксильными группами носителя, в соответствии с методом, описанным Инманом и Динцисом [4]. Исследование зависимости количества отщепленных лигандов от pH и времени позволило установить, что отщепление «аффинантов» от матриц происходит преимущественно в месте присоединения к поверхности твердого носителя, а степень отщепления увеличивается при участии соседних карбоксильных и карбоксиамидных групп в полиакриламидных гелях и гидроксильных групп в агарозе, целлюлозе и поперечно-сшитых декстранах. Реакция отщепления носит общий характер и не зависит от структуры связанного аффинного-лиганда. Лиганды, присоединенные к по-лиакриламидным гелям посредством R-NH-CO-акриламидных связей, отщепляются более медленно.
Отщепление связанных лигандов можно подавить при использовании поливалентных вставок. Дальнейшее улучшение может быть достигнуто присоединением лигандов к носителю более прочными связями, такими, как в методе периодатного окисления или через эпоксидактивированную агарозу. Была изучена зависимость степени отщепления от используемого носителя. При выделении рецепторов эстрогенов и инсулина, на-
