Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
4) Промытые шарики суспендируют в 0,2 M NaHCO3 (pH 9,5; 10 объемов), содержащем присоединяемый лиганд. Концентрация лиганда зависит от его цены, химических свойств и доступности.
Для присоединения белков лучше всего использовать растворы с концентрациями 5—20 мг/мл, в то время как лиганды меньшей молекулярной массы могут присоединяться и при концентрациях 10—100 ммоль/л. В случае полиаминосоединения, например лизина, присоединение должно быть осуществлено преимущественно через a-, а не через є-аминогруппу путем понижения pH раствора для присоединения; используют 0,5 M фосфатный буфер (pH 6,0). По существу аналогично получают и используют ацилазидные производные полиакриламида.
6. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ
НА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ШАРИКАХ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГИДА
С. Арамэ (S. Avrameas)
6.1. Получение и активация шариков
Для гидратации полиакриламидных шариков их выдерживают в течение 24 ч в дистиллированной воде и затем несколько
Поперечно-сшивающие агенты
89
раз промывают дистиллированной водой. Промывание полиак-риламидных шариков продолжают до полной прозрачности промывных вод.
€.2. Активация шариков
1) Отделенные декантацией шарики (100 мл) прибавляют к дистиллированной воде (250 мл), к смеси добавляют 1,0 M фосфатный буфер (pH 7,4; 50 мл) и 25%-ный (об./об.) глутаро-вый альдегид (100 мл).
2) Смесь оставляют при 37 °С на ночь.
3) Шарики тщательно промывают дистиллированной водой [промывные воды отделяют последовательными декантациями, путем использования пористого стеклянного фильтра или многократным центрифугированием при 4000 об/мин (например, для биогеля P 300—400 меш)] до отсутствия запаха глутараль-дегида и поглощения при 280 нм в промывных водах.
Подготовленные таким образом активированные шарики можно хранить в дистиллированной воде при 40C по крайней мере в течение месяца без заметной потери белок-связывающей емкости.
€.2.1. Присоединение белков к активированным шарикам. После центрифугирования шарики (10 мл) прибавляют к присоединяемому белку (10—50 мг) в фосфат-ЫаСЬбуфере (10 мл; состав: 0,01 M фосфат, pH 7,4, содержащий 0,15 моль/л NaCl). Суспензию перемешивают на роторном смесителе в течение ночи при комнатной температуре (или в случае необходимости при 40C).
6.2.2. Емкость гелей. С гелем может связаться максимально ^3 мг белка на 1 мл геля. Если требуется высокое содержание белка в геле, то в реакцию присоединения следует вводить 30—50 мг белка. В то же время следует заметить, что если требуется иммобилизовать как можно больше введенного в реакцию белка, нужно использовать относительно низкую концентрацию белка (10—20 мг) в растворе для реакции присоединения.
6.2.3. Выбор геля. Для колоночных процессов обычно применяются биогель P 300 (50—100 меш) и акриламид-агарозные шарики. Для бетч-процессов рекомендуется биогель P 300 (400 меш). Аналогичные методики описаны для магногеля 44 (см. гл. 1, разд. 2.6 и 8 и в литературе к гл. 1 работу [4]).
90
Глава З
7. МЕТОДИКИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИВИНИЛСУЛЬФОНА
7.1. Активация агарозных шариков
1) Влажную агарозу (10 г) промывают водой; воду удаляют путем отсасывания.
2) Агарозу суспендируют в 1,0 M бикарбонате натрия (pH 11,0; 10 мл).
3) К суспензии добавляют дивинилсульфон (2 мл).
4) Реакцию продолжают при перемешивании около 1 ч при комнатной температуре.
5) Шарики промывают водой. Осторожно! Дивинилсульфон токсичен.
7.2. Присоединение к дивинилсульфон-агарозе
1) Амино- или гидроксилсодержащий лиганд растворяют в 1,0 M карбонате натрия до получения раствора с концентрацией 250 мг/мл.
2) Этот раствор прибавляют к активированной дивинилсульфон-агарозе (10 г) и осторожно перемешивают. Необходимое для полного взаимодействия время зависит от температуры реакции (например, при 500C реакцию продолжают 2 ч, а при 40C-24 ч).
3) По окончании реакции шарики промывают 1,0М Na2CO3 (pH 11,0; 10 мл), затем 0,2 M глицином-HCl (pH 3,0), содержащим 1,0 M NaCl (500 мл), 1,0 M NaCl (500 мл) и водой (500 мл).
8. МЕТОДИКИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ, ОСНОВАННЫЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДИАЗОНИЕВЫХ ГРУПП
8.1. Получение NAD-агарозы
.1) Готовят, как описано в гл. 2 (разд. 1), охлажденную и промытую CNBr-активированную сефарозу (50 мл).
2) Воду удаляют путем отсасывания на пористом стеклянном фильтре.
3) Гель перемешивают в течение ночи при 4 0C в 1,0 M гексан-1,6-диамине (100 мл), предварительно доведенном до pH 10,0 при помощи HCl.
4) Аминогексил-агарозу тщательно промывают дистиллированной водой и готовят суспензию в 50%-ном (об./об.) водном предварительно перегнанном диметилформамиде; смесь перемешивают в течение 3—4 ч при комнатной температуре с 250 мл
Поперечно-сшивающие агенты
91
раствора 0,07 M л-нитробензоилазида в смеси 40% (об./об.) диметилформамида — 60% 0,2 M бората (pH 9,3).
5) л-Нитробензамидогексил-агарозу промывают 50%-ным (об./об.) диметилформамидом (1 л) и дистиллированной водой.
6) Гель перемешивают в течение 1 ч при 37 °С в 0,5 M NaHCO3, содержащем 0,1 моль/л дитионита натрия (pH 8,5; 150 мл).
7) Полученную я-аминобензамидогексил-агарозу промывают дистиллированной водой (1,5 л), охлаждают до 0°С; прибавляют в течение 10 мин 2,5 объема охлажденного 0,1 M NaNO2 в 0,5 M HCl при перемешивании.
