Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 32

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 106 >> Следующая

3) Добавляют при постоянном перемешивании ІМ^'-дицикло-гексилкарбодиимид (до концентрации 0,1 моль/л) и продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 70 мин.
4) Шарики отделяют путем фильтрования с отсасыванием на
86
Глава З
пористом стеклянном фильтре и промывают диоксаном (8 объемов), затем метанолом (3 объема) (метанол удаляет находящуюся в осадке дициклогексилмочевину).
5) Шарики промывают диоксаном (3 объема) и либо используют немедленно, либо при необходимости хранения тщательно сушат.
6) Для высушивания шарики промывают диоксаном (3 объема), обезвоженным пропусканием через колонку с нейтральным оксидом алюминия.
7) Суспендируют шарики в высушенном оксидом алюминия диоксане (2 объема), переносят в темную склянку, содержащую молекулярные сита (тип 4А или 5A), и герметически закрывают.
При использовании этой методики менее 10% N-гидрокси-сукцинимидных эфиров гидролизуется за период 4-месячного хранения.
3.1. Присоединение лигандов к агарозе, содержащей гидроксисукцинимидные сложноэфирные группы
1) Шарики переносят на пористый стеклянный фильтр при отсасывании, быстро промывают ледяной водой и добавляют к раствору лиганда в соответствующем буфере (5 объемов буфера на объем геля). В реакции можно использовать pH в интервале 5—9 при условии устойчивости лиганда при этом pH. Ацетатные, цитратные, фосфатные, боратные и бикарбонатные буферы вполне пригодны и не оказывают влияния на реакцию присоединения. Время реакции можно варьировать от 10 мин до 6 ч в зависимости от используемого pH и лиганда.
2) Реакцию прекращают путем добавления этаноламина или глицина до концентрации 1,0 моль/л. Эти амины реагируют с избытком активированного эфира.
3) Через 2 ч при комнатной температуре шарики промывают буфером, в котором далее будет использоваться матрица.
Эта методика может быть применена к карбоксиметил-цел-люлозе, карбоксиакриламиду и карбоксипроизводным эупергита С или стекла с контролируемым размером пор.
4. ПОЛУЧЕНИЕ СУКЦИНИЛИРОВАННОИ АМИНОАЛКИЛ-АГАРОЗЫ
4,1. Получение N-алкиламин-агарозы
1) Агарозу промывают на пористом стеклянном фильтре дистиллированной водой (10 объемов).
2) Агарозу (100 г) суспендируют в воде (80 мл). Добавляют 1,0 M периодат натрия (20 мл).
Поперечно-сшивающие агенты
87
3) Встряхивают суспензию в течение 2 ч при комнатной температуре (лучше в темноте).
4) Окисленную агарозу промывают водой.
5) Окисленную агарозу прибавляют к 2,0 M солянокислому алкилдиамину (например, солянокислому гексаметилендиами-ну; pH 5,0; 100 мл).
6) Через 6—10 ч при комнатной температуре доводят pH до
9,0.
7) Шарики охлаждают до 0—4 °С и очень медленно (за 12 ч) добавляют 5,0 M борогидрид натрия (10 мл).
8) Тщательно промывают шарики 1,0 M NaCl; для этого шарики помещают на пористый стеклянный фильтр и в течение 3—5 ч пропускают через них раствор NaCl, причем раствор не отсасывают.
9) Оставляют шарики в 1,0 M NaCl на ночь.
10) Шарики промывают на фильтре 1,0 M NaCl в течение 3—5 ч, как в стадии 8.
4.2. Сукцинилирование
1) Аминоалкил-агарозу суспендируют в воде (1 объем) и добавляют янтарный ангидрид (10-кратный избыток по аминогруппам на агарозе), поддерживая pH 6,0 с помощью 5,0 M NaOH.
2) Постоянно контролируют pH, пока pH не будет оставаться постоянным по крайней мере в течение 30 мин без дальнейшего добавления NaOH.
3) При необходимости температуру реакционной смеси (25— 300C) поддерживают с помощью ледяной бани.
4) Смесь оставляют на 5 ч при 4 0C, затем фильтруют с отсасыванием и промыванием дистиллированной водой.
5) Для определения полноты протекания реакции отбирают пробу шариков и обрабатывают ее нингидрином. Если появляется слабая сине-фиолетовая окраска, процесс сукцинилирова-ния повторяют, вновь добавляя избыток янтарного ангидрида; суспензию оставляют на 5 ч при комнатной температуре.
5. АЦИЛАЗИДНАЯ АКТИВАЦИЯ
5.1. Получение гидразидо-агарозы
1) Адипоилгидразид получают путем кипячения диэтилового эфира адипиновой кислоты (100 мл) с гидразингидратом (200 мл) и этанолом (200 мл) в течение 3 ч. По охлаждении реакционной смеси до комнатной температуры осаждается адипоилгидразид.
88
Глава З
2) Адипоилгидразид перекристаллизовывают из водного этанола (т. пл. 169—1710C).
3) Шарики CNBr-активированной агарозы, полученные, как описано в гл. 2, смешивают с насыщенным на холоду раствором адипоилдигидразида в 0,1 M Na2CO3 (pH 9,0; 2 объема).
4) Шарики осторожно встряхивают в течение ночи и затем тщательно промывают на пористом стеклянном фильтре дистиллированной водой, 2,0 M NaCl и вновь дистиллированной водой.
5.2. Получение ацилазидо-агарозы
Ниже описана методика перевода гидразидо-агарозы в ацилазидо-агарозу.
1) Шарики гидразидо-агарозы суспендируют в ледяной 1,0 M HCl (1 объем). К суспензии добавляют ледяной 0,5 M NaNO2 (1 объем).
2) Поддерживают температуру O0C в течение 15—20 мин, шарики отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре с отсасыванием и промывают ледяной 0,1 M HCl.
3) Из склянки для отсасывания выливают фильтрат и шарики быстро промывают ледяной 0,1 M сульфаминовой кислотой и затем ледяной водой.
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 106 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed