Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
118
Глава 4
8.6. Изменение буфера и/или pH
Иногда совершенно неожиданно полученные результаты можно использовать в практических целях. Так, факт, что для связывания глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы с гелем матрекс оранжевый В требуются определенные ионы, привел к разработке удобного препаративного метода очистки этого фермента.
1) Колонку (2 мл, 3,0X0,8 см) с гелем матрекс оранжевый В (концентрация лиганда 17,2 мг/г геля) уравновешивают 50 мМ трис-HCl буфером, pH 7,8.
Номер фракции
Рис. 10. Хроматография глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы из L. mesenteroides на геле матрекс оранжевый В с использованием обратного градиента
трис-НС! [18].
2) На колонку наносят образец частично очищенной глюко-за-6-фосфатдегидрогеназы (40 Е, 7,3 мг, уд. акт. 5,5 Е/мг), которую получают пропусканием неочищенного бактериального ци-тозоля через колонку с гелем матрекс пурпурный А.
3) Колонку промывают уравновешивающим буфером (12 мл) при скорости потока 4 мл/ч и отбирают фракции по 1 мл до тех пор, пока поглощение элюента при 280 нм не станет ниже 0,05.
4) Через колонку пропускают обратный градиент трис-НС1-буфера (pH 7,8; 30 мл) при изменении концентрации от 50 до 0 ммоль/л. Градиент готовят в обычном смесителе, но меняют порядок расположения резервуаров на обратный так, чтобы 50 мМ буфер располагался первым к входу в колонку.
5) Все фракции контролируют по поглощению при 280 нм и анализируют на ферментативную активность и содержание белка; полученные данные используют для расчета выхода и степени очистки.
Типичные результаты представлены на рис 10.
Методики эксперимента
119
8.7. Хаотропные реагенты
В табл. 4 перечислены некоторые реагенты, используемые для десорбции комплексов антиген — антитело, когда один из двух компонентов иммобилизован на твердом носителе. Многие из них относятся к хаотропным реагентам. Необходимые концентрации додецилсульфата натрия, мочевины или солей гуа-нидиния, иодида или тиоцианата приведены также в табл. 4.
8.8. Электрофоретическая десорбция
Электрофоретическая десорбция была разработана для мягкого удаления заряженного вещества с аффинных матриц, в особенности с иммуноадсорбентов, без использования хаотропных реагентов [37, 38]. Метод дает прекрасные выходы и применим во всех случаях, когда имеет место обратимое равновесие при взаимодействии компонентов аффинной системы. Он ис-
Таблица 4. Некоторые элюенты, используемые для десорбции с иммуноадсорбентов [20]. (Воспроизведено с разрешения.)
Гаптен Элгсецт Литература
1) Кислоты (pH 3)
Инсулин Инсулин Анти-ДНФ аминокислоты Аллергены амброзии высокой 2) Соли 0,01-т-1 M HCI 1 M уксусная кислота, pH 2,0 20%-ная (об./об.) муравьиная кислота Глицин-HCl, pH 2,8 DmUHH-H2SO4, pH 2,7 1 M пропионовая кислота 21 22 23 24 25
IgG Вирус Semliki Forest 0,2-7-2 M тиоцианат натрия 2,5 M NaI, pH 7,5 2,8 M MgCl2 Карбонат/бикарбонат, pH 11 26 27 28 29
3) Вещества, денатурирующие белки
дсн . Соматомаммотропин хориона человека ?-Липопротеин Галактозидаза 0,01-г0,1 (масс/об.) ДСН 6 M гуанидин-HCl pH 3,1 4 M мочевина 8 M мочевина 30 31 32
4) Гаптены
л-Аминофениллактозид ДНФ-лизин 0,5 M лактоза ДНФ, ДНФ-лизин 33 34
5) Другие элюенты
Человеческий комплемент Cl IgG 0,2 M 1,4-диаминобутан Дистиллированная вода 35 36
120
Глава 4
ключает необходимость элюирования конкурентным лигандом,. а также концентрирование больших объемов элюата. Метод, электрофоретической десорбции опробован на многих системах: антистероидные антитела — иммобилизованный стероид [39,. 40], иммуноглобулин — иммобилизованный белок А [41], второе антитело против Con А — иммобилизованный Con А [41],. ферритин — иммобилизованные антитела против ферритина
циркуляция буфера
камера
Рис. 11. Десорбционная ячейка для удаления связанных макромолекул с аффинных гелей с помощью электрических полей [44]. (Воспроизведено с
разрешения.)
[42], глобулин, связывающий половой гормон — иммобилизованный андростандиол [43] и человеческий сывороточный альбумин— иммобилизованный цибакрон голубой 3G-A [44].
Электрофоретическую десорбцию белка с матрицы можно осуществить с использованием модифицированной ячейки Macro для электрофореза в полиакриламидном геле (Birchover Instruments Ltd., Великобритания), устройство которого изображено на рис. 11. Полиакриламидный гель (7,5%-ный) должен иметь углубление по центру на верхней поверхности для предотвращения возможной потери матрицы. Диск пористого полипропилена, находящийся на выступе геля, предотвращает взмучивание матрицы, вызываемое высокими скоростями циркуляции буфера (500 мл/мин). Циркуляция буфера в свою очередь предотвращает любые возможные локальные изменения pH. Перед нанесением матрицы гели предварительно подвергают
Методики эксперимента
121
электрофорезу в течение 30 мин. Направление тока должно быть таковым, чтобы при используемом pH белки мигрировали через гель к элюционной камере.
Прибор оснащен 12-канальной, записанной на перфокарте программой, по которой происходит автоматический контроль подачи электроэнергии и периодический отбор жидкости из де-сорбционной камеры. Температура буфера в процессе электрофореза поддерживается при помощи охлаждающего змеевика, погруженного в резервуар для буфера и соединенного с термостатом и насосом. В отбираемых из десорбционной камеры пробах (десорбат) определяется содержание белка. При оптимизации указанного выше процесса могут быть получены хорошие выходы.
